摘要
在大约三分之一的人类癌症中，肿瘤抑制蛋白p53被其两种负性调节因子MDM2和MDM4所抑制。研究表明，一种称为PMI的十二肽可以与MDM2和MDM4结合，激活抑癌蛋白p53并改善其稳定性，从而恢复其抗肿瘤活性，抑制肿瘤的发展。但PMI作为一种多肽，其生物应用受到多种限制，如血液循环过程中的不稳定性、易被蛋白酶降解、半衰期短、免疫原性以及难以穿过细胞膜进入细胞等。为了克服这些困难，本课题首次设计并生物合成了一种PMI的融合蛋白Trx-ANN-pHLIP-NLS-PMI(TApNP)，其中硫氧还蛋白（Trx）用于提高重组蛋白的表达量、溶解度和代谢稳定性；ANN能响应肿瘤微环境过表达的天冬酰胺内肽酶而被切断；低pH插入肽（pHLIP）能在肿瘤酸性环境中插入细胞膜将连接于其C端的分子递送至细胞内；核定位信号肽（NLS）用于引导PMI进入细胞核，靶向位于核内的MDM2/MDM4与p53的相互作用。通过原核表达系统获得TApNP后，对其细胞内化、核摄取情况和抗肿瘤活性进行了评价，同时表达了不含NLS的融合蛋白Trx-ANN-pHLIP-PMI(TApP)并用游离PMI作为对照。本论文主要包括以下三个部分研究内容： （1）分别通过无缝克隆和全质粒PCR构建了重组质粒pET32a-ANN-pHLIP-PMI和pET32a-ANN-pHLIP-NLS-PMI，使用原核表达系统成功表达了融合蛋白TApP和TApNP，并利用镍柱进行了纯化。分别通过SDS-PAGE、Westernblot和质谱对两种蛋白进行了系统表征，证明两种蛋白均成功表达。使用圆二色谱测定了TApP和TApNP的二级结构和热稳定性，并对其血清稳定性进行了检测，结果表明两种蛋白的主要二级结构均为α螺旋，同时具有较强的热稳定性和血清稳定性。 （2）用FITC标记PMI、TApP和TApNP，紫外可见分光光度计证实三种蛋白均被成功标记。使用HCT116细胞，分别通过DeltaVision和流式细胞术对三种FITC标记蛋白的细胞内化情况进行了观察和量化，证明含有pHLIP的FITC-TApP和FITC-TApNP能够在pH6.5的条件下有效进入细胞。通过酶标仪检测了三种蛋白的细胞核摄取情况，结果表明TApNP中的NLS序列能够有效引导PMI进入细胞核。 （3）选用p53野生型HCT116细胞，通过MTT、结晶紫染色、Calcein-AM/PI染色和EdU染色等方法对PMI、TApP和TApNP的抗肿瘤活性进行了检测，证明含有pHLIP的TApP和TApNP在酸性环境中能够有效抑制肿瘤细胞增殖，且TApNP具有最强的抗肿瘤活性。 综上所述，本研究首次设计并表达了可靶向激活抑癌蛋白p53的肿瘤酸度响应功能多肽Trx-ANN-pHLIP-NLS-PMI（TApNP），并对其理化特征、细胞内化、核摄取情况和抗肿瘤活性进行了全面评价。结果表明，在弱酸性环境中，TApNP能够将PMI输送至细胞内并引导其到达细胞核，有效抑制肿瘤细胞的增殖。
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