摘要
连翘叶为木犀科植物连翘[Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl]的叶子，据《中华本草》记载“连翘茎叶，性凉味苦，清热解毒，归心、肺经，治心肺积热”。目前，连翘叶作为连翘的非药用部位，少量用于制成连翘叶茶，大部分都未得到有效利用，造成了资源的极大浪费。因此，高效开发利用连翘叶资源就显得尤为重要。 随着经济的发展和生活水平的提高，人们也逐渐意识到人体的疾病与衰老同自身的氧化应激关系密切，现代研究发现自由基在引起癌症、心脑血管疾病过程中是一个重要因素。因此，抗氧化剂的研究对疾病的预防具有重要意义。 通过文献调研发现，连翘叶具有抗氧化、保肝、抗炎、抑菌等多种药理活性，而抗氧化活性与上述药理活性具有一定的关联，因此筛选出其中的抗氧化活性成分具有重要意义。本课题组前期研究发现：连翘叶经发酵后，其化学成分发生了较大变化，木脂素苷元的种类和含量均有提高，且抗氧化和抗炎活性也相应提高。鉴于此，本论文在前期工作的基础上，建立了主要木脂素成分含量测定方法、进一步优化完善了富含连翘脂素提取物的纯化条件、分离制备了主要木脂素成分，最后对不同纯化部位和主要木脂素成分进行了体外抗氧化活性评价。具体内容如下： 1.以发酵连翘叶的乙醇提取物为实验对象，利用大孔吸附树脂作为纯化柱层析材料，以连翘脂素损失率、回收得率和连翘脂素含量为评价指标，研究确定了大孔吸附树脂分离纯化富含连翘脂素提取物的工艺参数。确定以40%乙醇为样品溶解溶剂，上样样品浓度为25mg/mL；上样量为3BV（柱体积）；柱径高比为1：6。柱层析洗脱条件为：用40%和50%乙醇依次分别洗脱5BV，然后再用80%和95%乙醇分别洗脱5BV和10BV，洗脱液流速为3BV/h。在上述条件下进行三次放大平行验证实验，连翘脂素总回收率约为82.0%，RSD值为1.19%。 2.利用HPLC对四个不同纯化部位中木脂素成分进行定性分析。结果显示：木脂素成分主要存在于80%、95%乙醇洗脱部位，主要为松脂素、表松脂素、连翘脂素和松脂素单甲基醚。然后，利用HPLC法建立了提取物中连翘脂素、松脂素、表松脂素和松脂素单甲基醚等主要成分的含量测定方法，并对其进行了方法学考察。连翘脂素标准曲线符合线性回归方程：y=9598.5x-68.773，相关系数R2=0.9998，线性范围0.02~1.0mg/mL。松脂素标准曲线符合线性回归方程：y=9555x+20.955，相关系数R2=0.9992，线性范围0.02~1.0mg/mL。表松脂素标准曲线符合线性回归方程：y=9089.9x+60.503，相关系数R2=0.9995，线性范围0.02~1.0mg/mL。松脂素单甲基醚标准曲线符合线性回归方程：y=8444.3x+5.8984，相关系数R2=0.9999，线性范围0.02~1.0mg/mL。方法学考察结果表明建立的测定方法具有良好的精密度、重复性和稳定性，RSD值均小于5%，可用于松脂素、表松脂素、连翘脂素和松脂素单甲基醚含量测定。 3.不同纯化部位及木脂素成分体外抗氧化活性评价：利用结晶、重结晶、硅胶柱色谱、制备液相色谱等分离技术对95%纯化部位中木脂素成分进行分离纯化，得到四个木脂素成分。经过本课题组前期研究和标准品比对，分别为连翘脂素、松脂素单甲基醚、表松脂素和松脂素。利用DPPH·法、ABTS·法和铁离子还原法三种抗氧化评价方法，评价了40%、50%、80%和95%乙醇洗脱的4个不同纯化部位，以及松脂素、表松脂素、连翘脂素、松脂素单甲基醚等4个主要木脂素成分的抗氧化活性。结果发现：各部位和单体成分均具有抗氧化活性，其中，80%乙醇纯化部位和表松脂素具有较强的抗氧化活性。80%乙醇纯化部位和表松脂素对DPPH·自由基清除率IC50值分别为0.0448mg/mL、0.0202mg/mL，对ABTS+·自由基清除率IC50值分别为0.0721mg/mL、0.0372mg/mL。
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