摘要
黑色素（melanin）是一类普遍存在于自然界的天然色素，它由酚类或吲哚类物质聚合而成。尽管黑色素不是生物体所必需，但其具有光吸收、防辐射、清除自由基等多种功能，能够为生物体提供生存优势。许多研究发现黑色素与阿兹海默症、白化病等疾病密切相关，因此，黑色素合成机制与生物学功能的研究一直以来备受人们关注。而过氧化氢酶（catalase,CAT）作为重要的抗氧化酶，普遍存在于需氧生物中，它能高效清除一类重要活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）—H2O2，对生物体维持正常ROS水平至关重要。 中间气单胞菌WS是本实验室从武汉东湖分离得到的一株黑色素高产菌株，前期实验证实，该菌株可通过尿黑酸（homogentisate，HGA）途径形成脓黑色素。将HGA途径的关键酶编码基因hppD敲除后，突变菌株完全失去产黑表型，说明脓黑色素是该菌的最主要色素。但在该菌培养液中同时也检测到特征性中间产物多巴（DOPA）及DOPA黑色素标志物的存在，说明该菌也能产生少量DOPA黑色素。此前曾一度认为WS菌株中过氧化氢酶（KatE）可能与DOPA黑色素形成有关。但有意思的是，实验证明katE敲除突变株的DOPA合成能力并未受到影响。相反，却使细菌黑色素合成下降约一半，而且合成过程提前，这一结果表明KatE以某种方式影响脓黑色素的合成。 本研究旨在探究KatE影响黑色素合成的原因。首先通过比较敲除突变株WSΔkatE与野生型菌株的生长曲线，发现敲除突变株的生物量似乎未受到影响。通过Real-timePCR检测HGA途径相关基因的转录情况，结果表明WSΔkatE的转录水平未受明显影响。而在实验中，无法提取培养24h后WSΔkatE的总RNA，因此猜测菌株生长状态可能受到了影响。通过检测WSΔkatE和不产黑菌株WSΔkatEΔhppD活菌数，发现WSΔkatE在稳定期（24h左右）突然死亡，WSΔkatEΔhppD却并未死亡，而这段时间菌株正在大量合成黑色素。综上，确定了敲除突变株WSΔkatE黑色素合成减少的原因是菌株在培养至稳定期（24h左右）发生突然死亡，黑色素合成或HppD蛋白是造成其死亡现象的关键原因。将WSΔkatE基因组上HGA途径中的各个基因分别进行敲除，发现仅能造成黑色素部分减产的WSΔkatEΔphhA、WSΔkatEΔtyrB均发生死亡；而失去产黑表型的WSΔkatEΔtyrBΔaspC与WSΔkatEΔhppD都能挽救死亡。因此，证实是黑色素合成过程造成WSΔkatE提前死亡。在此基础上，进一步探究WSΔkatE在不同培养条件的生长情况，发现WSΔkatE提前死亡与通氧量有关。结合KatE具有清除ROS的功能，通过检测WSΔkatE、WSΔkatEΔhppD培养19?24h的胞内ROS水平，发现WSΔkatE的ROS水平急剧升高，且远高于野生型菌株WS与WSΔkatEΔhppD，而此时WSΔkatE正在大量合成黑色素。由此可以确定，katE缺失导致菌株清除ROS能力下降，而黑色素在短时间内大量合成，同时会产生大量ROS，造成氧化压力过大，最终导致WSΔkatE提前死亡。另外，在合成黑色素的杀鲑气单胞菌AB98041中也发现了同样因katE缺失导致菌株提前死亡的情况，说明这种现象具有一定的普遍性。 我们对WSΔkatE的提前合成黑色素的原因也进行了探究。通过HPLC检测胞外的HGA，发现WSΔkatE相比于野生型，HGA特征峰提前消失，即提前发生自氧化，最终导致黑色素合成提前，这可能与胞外氧环境的变化相关。另外，前期通过电镜观察发现，WSΔkatE死亡后细胞形态仍保持完整。设想将该菌株作为生物反应器应用于工业生产中。在胞内尝试表达了两种工业酶，粗酶液酶活结果表明WSΔkatE与野生型相比，酶活并未受明显影响甚至更高。初步证明了WSΔkatE作为生物反应器的可行性。 综上所述，本研究揭示了过氧化氢酶在黑色素合成中的重要作用，丰富了对黑色素合成过程的认识，为黑色素生理学功能的应用开发奠定了基础。而且加深了对气单胞菌在水生环境中的进化适应性策略的理解，为工业化特色发酵菌株的构建提供了新思路。
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