摘要
本文从以下两部分进行阐述： 第一部分 组蛋白乙酰化在成牙本质细胞分化过程中的作用 研究目的：细胞分化过程受一系列基因时间和空间选择性表达的调节，但这种表达差异很少涉及DNA序列本身的改变。组蛋白乙酰化是表观遗传修饰中的一种，它能将乙酰基添加到组蛋白基团上，来调节基因转录。本课题组过去的研究发现，miRNA，ceRNA和甲基化等表观遗传修饰在成牙细胞本质分化过程中有重要作用，而组蛋白乙酰化是否会影响分化尚待阐明。在本研究中，我们试图探讨在成牙本质细胞分化过程中组蛋白乙酰化的作用及其作用机制。 研究方法：在本研究中，我们用免疫组化的方法，检测出生后两天小鼠切牙切片中H3K9ac和H3K27ac蛋白的表达模式。同时利用在体外分化诱导小鼠牙乳头原代细胞(mDPCs)向成牙本质细胞分化作为研究模型。mDPCs分化诱导O，7天，提取对应天数的蛋白，通过Westernblot检测H3K9ac和H3K27ac蛋白的表达。同时利用免疫荧光法检测他们的表达和定位。mDPCs分化诱导0，1，3，7，11，14天，提取对应天数的RNA，通过qRT-PCR技术检测乙酰化酶家族成员的表达模式。为了探索HDAC3和p300在细胞成牙本质向分化中的功能，在mDPCs细胞中过表达HDAC3的蛋白编码区(CDS)或者抑制p300的表达，并采用qRT-PCR技术和Westernblot检测成牙本质细胞分化过程中标志性基因DSPP，DMP1和ALP的表达水平。此外，茜素红染色检测过表达HDAC3或者抑制p300表达对矿化结节形成的影响。最后，我们分别用HDAC3和p300的抑制剂来验证他们对小鼠成牙本质细胞分化的作用。 研究结果：H3K9ac和H3K27ac在前期成牙本质细胞中表达很弱；在极化期的成牙本质细胞中表达稍有增强；在分泌期和成熟期的成牙本质细胞中表达进一步增强。在mDPCs分化过程中，H3K9ac和H3K27ac蛋白水平在第7天出现显著上调，免疫荧光染色显示在诱导第7天时，H3K9ac和H3K27ac信号强度明显增强，且表达主要集中在胞核中。过表达HDAC3可下调DMP1，DSPP和ALP的mRNA和蛋白表达水平，并抑制矿化结节的形成；抑制p300表达下调DMP1，DSPP和ALP的mRNA和蛋白表达水平，并抑制矿化结节的形成。HDAC3和p300的抑制剂的结果进一步证实了他们对调节小鼠成牙本质细胞分化的作用。 研究结论：组蛋白乙酰化在mDPCs向成牙本质细胞分化过程中有重要作用，分化过程中HDAC3和p300的协调表达可通过上调组蛋白乙酰化来促进成牙本质细胞分化。并且HDAC3和p300本身也可调节细胞成牙本质向分化。 第二部分 KLF4通过TGF-β信号通路和组蛋白乙酰化来调节Dmp1和Sp7的表达进而促进成牙本质细胞分化 研究目的：成牙本质细胞分化是一个受多基因调控的过程，同时也是牙本质形成的关键步骤。转录因子(TF)能够结合在启动子和增强子等顺式作用元件上来调节基因表达水平，从而调控不同的生理过程。我们之前的研究表明，KLF4能够调节牙乳头细胞和牙髓细胞的成牙本质向分化，但其机制尚待进一步研究。本研究试图探索KLF4在成牙本质细胞分化过程中的功能以及其调控Dmp1和Dspp的具体机制。 研究方法：在本研究中，我们使用了mDPCs，小干扰RNA(siRNA)技术敲低Klf4后，进行高通量测序（RNA-seq和ATAC-seq）。综合分析测序结果，挖掘Klf4调控的候选靶基因及信号通路。染色质免疫共沉淀(ChIP)检测KLF4在Dmp1和Sp7的启动子上有无结合位点，双荧光素酶实验(DLA)检测KLF4对Dmp1和Sp7的转录调控作用。进一步ChIP实验检测成牙本质细胞分化前后KLF4靶基因Dmip1和Sp7启动子上组蛋白乙酰化修饰的改变。免疫共沉淀和免疫荧光探讨KLF4和组蛋白乙酰化酶HDAC3和p300是否存在相互作用及其对下游靶基因转录的影响。 研究结果：RNA-seq和ATAC-seq提示Klf4能直接结合到Dmp1和Sp7启动子上，ChIP和DLA进一步确认了KLF4对Dmp1和Sp7的转录调控作用。ATAC-seq还提示在成牙本质细胞分化早期，Klf4和Runx2共同激活TGF-β信号通路。ChIP实验发现在成牙本质细胞分化过程中，Dmp1和Sp7启动子上组蛋白乙酰化水平升高，同时存在p300富集增加而HDAC3富集减少。免疫共沉淀和免疫荧光表明KLF4能与HDAC3、p300相互作用，其作用模式为：在分化起始阶段，KLF4主要和HDAC3相互作用，而随着分化的进行，KLF4主要结合p300，以此来调节KLF4对下游靶基因Dmp1和Sp7的转录调控作用。 研究结论：KLF4通过调控TGF-β信号通路和组蛋白乙酰化来调节Dmp1和Sp7的转录，进而调控成牙本质细胞分化。
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