摘要
孤独症谱系障碍(Autismspectrumdisorder，ASD)是一类神经发育障碍性疾病。本课题以斑马鱼为模型，旨在明确nexmif敲降或敲除对斑马鱼脊髓运动神经元形态发育和ASD行为表型的影响，并探讨潜在的调控机制，为nexmif缺失所致ASD运动障碍提供治疗靶点并为后续的药物筛查提供研究对象。 第一部分 Nexmif基因在斑马鱼中的定位表达 目的: 明确斑马鱼中两个同源基因nexmifa及nexmifb的时空表达模式。 方法: (1)收取受精后36小时(36hourspost-fertilization，36hpf)、48hpf、72hpf及96hpf野生型斑马鱼胚胎，整胚胎原位杂交(whole-mountinsituhybridization，WISH)技术检测以上时间点nexmifa及nexmifb的表达情况。 (2)收取特异性标记运动神经元的Tg(mnxl:EGFP)品系和特异性标记内皮细胞的Tg(kdrhEGFP)品系72hpf时间点胚胎，用流式细胞仪分选出两个品系的GFP阳性细胞，分别行逆转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymemsechainreaction，RT-PCR检测两组胚胎的nexmifa、nexmitb及运动神经元特异性表达基因mnx1的表达情况。 结果: (1)nexmifa及nexmifb特异性表达于中枢神经系统，包括大脑及脊髓。自36hpf时，nexmifa及nexmifb己表达于中枢神经系统，随着胚胎发育，nexmifa及nexmifb的表达量渐增，48hpf时达高峰，后渐减少。 (2)mnxl、nexmifa及nexmifb表达于标记运动神经元的Tg(mnxl:EGFP)品系上，而不表达于标记内皮细胞的Tg(kdrhEGFP)品系上。 结论: nexmifa及nexmifb定位表达于大脑及脊髓，且表达在运动神经元上。 第二部分 Nexmif敲降导致脊髓运动神经元形态及行为学表型异常 目的: 利用反义吗啉环寡核苷酸(Morpholino，MO)技术建立nexmifa敲降及nexmifb敲降模型，从而人为的短时间调低nexmifa及nexmifb的基因表达水平。观察nexmifa敲降及nexmifb敲降对斑马鱼脊髓运动神经元形态的发生包括初级运动神经元(Primarymotorneurons，PMNs)是否缺失、caudalprimary(CAP)长度及每1mmCap上的分支数量的影响及对自由运动、旷场实验、明暗刺激实验、群集实验的行为学影响。 方法: (1)根据nexmifa及nexmifb的序列特点设计分别用于敲降nexmifa及nexmifb基因的引物序列，送公司合成nexmifaMO及nexmifbMO试剂。在斑马鱼胚胎1.2细胞期分别注入nexmifaMO及nexmifbMO得到nexmifa敲降组(Nexmifamorphant)及nexmifb敲降组(Nexmifbmorphant)斑马鱼。 (2)体外构建工具质粒，将nexmifbMO序列结合位点插入带有EGFP报告基因的PCS2+质粒中，从而构建出带有nexmifbMO结合位点以及报告基因EGFP的PCS2+质粒。将构建好的质粒与nexmifbMO共注或单独注射于1-2期野生型AB品系斑马鱼胚胎，36hpf时共聚焦荧光显微镜下检测单独注射带有nexmifbMO结合位点以及报告基因EGFP的PCS2+质粒的斑马鱼及带有nexmifbMO结合位点以及报告基因EGFP的PCS2+质粒与nexmifbMO共注的斑马鱼是否有绿色荧光。 结果: (1)RT-PCR提示野生对照组斑马鱼PCR产物仅在250bp附近出现一条条带，而nexmifa敲降组除250bp附近条带外，还产生了异常条带。送测结果提示nexmifa敲降组外显子2和外显子3之间插入了一段181bp的内含子2序列。 (2)共聚焦下发现单独注射插入nexmifbMO序列的EGFP-PCS2+质粒斑马鱼36hpf时出现绿色荧光，而与nexmifbMO试剂共注的插入nexmifbMO序列的EGFP-PCS2+质粒斑马鱼36hpf时无绿色荧光。 结论: (1)nexmifa及nexmifb基因的敲降均可导致脊髓运动神经元形态发生异常。 (2)nexmifa及nexmifb基因的敲降所致的PMNs丢失并非由凋亡导致。 (3)nexmifa及nexmifb基因的敲降均影响斑马鱼幼鱼自由运动能力、趋触性、对光线刺激的反应能力及社交距离。 (4)nexmifa敲降及nexmifb敲降导致的自由运动障碍由脊髓运动神经元形态异常所致而非肌肉异常所致。 第三部分 Nexmif除导致脊髓运动神经元形态及行为学表型异常 目的: 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建可稳定遗传的nexmif基因敲除突变模型。观察nexmif敲除对斑马鱼脊髓PMNs形态发育包括PMNs是否缺失，Caps长度及每lmmCaps上的分支数量的影响及对幼鱼自由运动、旷场实验、明暗刺激实验、群集实验，成鱼自由运动、旷场实验、群集实验、新缸实验及社交亲好实验的行为学影响。 方法: (1)利用CRISPR/Cas9分别构建nexmifa、nexmifb敲除模型。 (2)检测对照组、nexmif敲除突变体72hpf孵化率及鱼体体轴长度。 (3)共聚焦荧光显微镜下观察对照组、nexmif敲除组48hpf时间点及72hpf时间点脊髓运动神经元形态。 结果: (1)Sanger测序提示nexmifa敲除突变体建立成功，系插入了159bp的移码突变类型，nexmit5敲除突变体构建失败。 (2)72hpf时间点nexmifa突变体组(Nexmifamutant)孵化率及体轴长度较对照组少，差异均有统计学意义(P＜0.01)。 (3)nexmifa敲除突变体斑马鱼48hpf及72hpf时间点具有正常PMNs的胚胎率、Caps长度及每lmmCaps分支数量均小于同时间点对照组，差异均有统计学意义(P＜O.01)。 结论: (1)nexmifa基因敲除可导致脊髓运动神经元形态发生异常。 (2)nexmifa基因敲除所致的PMNs丢失并非由于凋亡所致。 (3)nexmifa基因敲除斑马鱼呈现出ASD表现。 (4)nexmifa敲除导致的自由运动能力障碍由脊髓运动神经元形态异常所致而非肌肉异常所致。 第四部分 Nexmif参与调控脊髓运动神经元形态的机制研究 目的: 利用转录组学寻找候选基因，探讨nexmif基因调节脊髓运动神经元形态发生及行为的机制。 方法: (1)分别收集对照组、nexmifa敲降组及nexmifb敲降组72hpf胚胎，行转录组学测序。 (2)qRT-PCR法检测对照组VSnexmifa敲降组与对照组VSnexmifb敲降组轴突导向通路上共同下调盼的20个差异基因。 (3)WISH检测对照组efna5b、sema6ba及ntn2在24hpf、48hpf及72hpf时间点的表达情况。 结果: (1)对照组VSnexmifa敲降组及对照组VSnexmifb敲降组中很多差异基因富集在神经相关的各种通路上(差异倍数＞2或＜O.5，P＜0.05)。对照组VSnexmifa敲降组与对照组VSnexmifb敲降组间有共同差异基因富集在轴突导向通路及各种突触通路上。其中轴突导向通路上有21个共同差异基因下调。 (2)qRT-PCR提示20个轴突导向通路上共同下调的的差异基因中大多数变化趋势与转录组学一致，包括转录组中下调的efna5b、sema6ba及ntn2三个基因。 (3)原位杂交发现efna5b、sema6ba及ntn2三个基因均主要表达在大脑及脊髓。 结论: (1)本研究利用RNA-seq技术对Ctrl、nexmifa敲降及nexmifo敲降组测序，筛选出大量与本研究中观察到的异常脊髓运动神经元轴突形态表型一致的轴突导向通路差异基因，进一步肯定了nexmif可以调节脊髓运动神经元轴突形态发生。 (2)nexmifa敲降及敲除、nexmifb敲降后脊髓运动神经元轴突形态发生异常，轴突导向因子efna5b、sema6ba及ntn2下调，分别过表达efna5b、sema6ba及ntn2后能部分逆转nexmifa敲除及nexmifb敲降导致的异常脊髓运动神经元形态，揭示了nexmifa及nexmifb通过efna5b、sema6ba及ntn2三个不同家族的轴突导向因调节脊髓运动神经元发育期形态发生。 (3)nexmifa及nexmifb可与ntn2直接结合从而调节脊髓运动神经元发育期形态发生。
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