摘要
研究背景： 免疫检查点抑制剂(immunecheckpointinhibitors,ICIs)疗法是一种以靶向肿瘤细胞或免疫细胞表面的免疫检查点蛋白为特征，激活抗肿瘤免疫发挥杀伤肿瘤作用的新兴癌症治疗方法。以抗程序性细胞死亡（配体）-1(anti-programmedcelldeath(ligand)-1,anti-PD-1/PD-L1)药物和抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(anti-cytotoxicTlymphocyte-associatedantigen4,anti-CTLA4）药物为代表的ICIs，已在多种肿瘤的晚期治疗中被证明较常规的放化疗更能有效的延长患者的总生存时间（overall-survival,OS）。然而尽管ICIs具有巨大的潜力，但临床应用中发现并不是所有的患者都能产生良好的应答反应。因此，通过生物标志物(biomarker)预测免疫治疗疗效帮助临床筛选出能够从免疫治疗中获益的人群显得至关重要。 生物标志物反映肿瘤免疫微环境以及肿瘤细胞的固有特性，在以往的研究中，已经发现了一些可用于检测患者对ICIs敏感性的生物标志物，包括，肿瘤组织的程序性细胞死亡配体-1免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC)，肿瘤突变负荷(tumormutationalburden,TMB)，微卫星不稳定性(microsatelliteinstability,MSI)，和基于检测mRNA表达的多基因预测模型。但在临床的实践中，它们都暴露出一定程度的问题。PD-L1IHC结果和患者应答反应不完全一致，存在染色结果阳性的患者对ICIs不敏感，而染色结果阴性的患者对免疫治疗有良好应答的现象。TMB的计算缺乏公认标准的公式，也没有一个绝对确定的阈值来区分患者肿瘤突变负荷是高是低。MSI的评价则会受瘤内空间异质性的影响，取肿瘤不同部位评估时，可能会得到不一样的结果。而基于检测mRNA表达的多基因预测模型在临床实践中价格昂贵。因此，寻找新的生物标志物，对筛选敏感患者实现肿瘤ICIs精准疗法具有重大意义。 ICIs的疗效受肿瘤微环境(tumormicroenvironment,TME)影响。肿瘤细胞和其生存的微环境作用复杂，形成了非常特殊的免疫景观。TME内浸润着多种天然免疫细胞和获得性免疫细胞，包括T细胞、自然杀伤细胞(naturalkillercells,NKcells)、树突状细胞(dendriticcells,DC)等。这些细胞在正常的免疫环境下，扮演着监视肿瘤细胞，阻止肿瘤细胞增殖的作用。但是在肿瘤微环境内，受肿瘤细胞和其自身的交互影响，其功能状态发生改变，从而直接影响免疫检查点疗法的疗效。比如，研究表明瘤内良好的效应T细胞浸润预示良好的ICIs疗效，而瘤内大量T细胞呈现功能耗竭表型(Tcellexhaustion)则与ICIs治疗的无响应有关。中性粒细胞(neutrophils)和肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophag)可以阻止其他免疫细胞激活并介导肿瘤细胞免疫逃逸，它们的浸润和功能状态同样影响ICIs的疗效。从肿瘤微环境着手，探索新的ICIs疗法生物标志物，能够增进对肿瘤免疫治疗的理解，为生物标志物的临床实践打下坚实的理论基础。 RNA测序技术(RNAsequencing,RNAseq)的应用与普及为了解不同个体的肿瘤微环境提供了可能。RNAseq能够准确清晰的提供组织样本转录组信息，包括RNA表达水平和基因突变信息。现如今已有多个免疫治疗队列公开了临床信息和测序数据。癌症基因组图谱(TheCancerGenomeAtlas,TCGA)项目也为研究基因与肿瘤微环境的关系提供了足够多的样本。这里，我们课题组拟收集癌症基因组图谱数据的测序数据和临床信息，探索具体单个基因与TME的关系，并在免疫治疗队列中验证具体基因对免疫治疗预后的影响，通过生物信息学工具，探索潜在的ICIs生物标志物及其可能的作用机制，以期为后续生物标志物的开发提供理论基础。 方法： 1.公共数据收集和整理 1.1 TCGA数据库内患者转录组信息，突变信息和临床信息的收集和整理。 1.2 ICIs治疗队列患者转录组信息，突变信息和临床信息的收集和整理。 1.3 人类蛋白图谱(TheHumanProteinAtlas,HPA)数据库内患者免疫组织化学染色数据的收集和整理。 1.4 根据转录组信息中具体基因表达量的中位数将TCGA队列内患者分为高表达与低表达两组。 1.5 根据转录组信息中具体基因表达量的中位数将ICIs治疗队列内患者分为高表达与低表达两组。 2.基因富集分析(GeneSetEnrichmentAnalysis,GSEA) 2.1 从已公开的研究中收集免疫细胞基因集和伽马干扰素(Interferongamma，IFN-γ)基因集。 2.2 从GSEA数据库，BioCarta和Reactome数据库收集免疫功能特征基因集。 2.3 运用GSEA富集分析查看免疫基因集在TCGA汇总队列中高低组的富集情况。 2.4 运用GSEA富集分析查看免疫基因集在TCGA独立瘤种队列中高低组的富集情况。 2.5 运用ssGSEA算法对TCGA患者及ICIs治疗队列患者进行免疫细胞或免疫功能评分。 3.统计分析 3.1 运用卡方检验(chi-squaretest)对比高低组患者对ICIs应答率的差异。 3.2 运用单基因考克斯(univariatecox)模型分析确定具体基因表达量高低对ICIs治疗预后的影响。 3.3 运用对数秩检验(log-ranktest)和乘积极限法(Kaplan-Meiermethod)检验ICIs治疗队列中高低组患者间总生存期的差异。 3.4 运用对数秩检验和乘积极限法检验TCGA队列中高低组患者间总生存期的差异。 3.5 运用皮尔森相关性分析检验具体基因和免疫细胞评分间是否存在相关性。 3.6 运用皮尔森相关性分析检验具体基因和免疫细胞相关基因间是否存在相关性。 3.7 运用Wilcoxon秩和检验比较ICIs治疗队列中具体基因表达量高低组免疫细胞评分的差异。 结果： 1.ENPEP是预测ICIs疗效的潜在生物标志物 1.1 在泛癌队列中，ENPEP的表达量与ICIs的预后存在联系。 1.2 在免疫队列中，ENPEP的表达量与ICIs的预后的联系普遍存在。 1.3 在泛癌队列中，ENPEP基因突变与ICIs的预后存在联系。 1.4 ENPEP的表达量不是常规治疗的预后因素。 1.5 ENPEP的表达量与肿瘤微环境中M2型巨噬细胞浸润和活化有关。 2.PD-L2是预测ICIs疗效的潜在生物标志物。 2.1 PD-L2高表达与肿瘤微环境内抗瘤免疫的激活存在相关性。 2.2 PD-L2的表达与ICIs的预后存在联系。 2.3 在TCGA汇总队列中，PD-L2表达水平不是常规治疗的预后因素。 2.4 免疫治疗队列中，PD-L2高表达和肿瘤微环境内激活的抗瘤免疫的联系依然存在。 3.SSTR2是预测ICIs疗效的潜在生物标志物。 3.1 SSTR2在多种肿瘤的微环境中均有表达。 3.2 SSTR2的高表达与肿瘤微环境内激活的抗瘤免疫相关。 3.3 在TCGA汇总队列中，SSTR2不是常规治疗的预后因素。 3.4 SSTR2的表达与ICIs的预后存在相关性。 结论： 1.ENPEP是预测ICIs疗效的潜在生物标志物； 2.PD-L2是预测ICIs疗效的潜在生物标志物； 3.SSTR2是预测ICIs疗效的潜在生物标志物。
NETL