摘要
目的: 1.探究哺乳动物Claudin-5（Cldn5）和斑马鱼Cldn5a、Cldn5b在脑组织中的表达图式。 2.分别构建斑马鱼cldn5a和cldn5b突变体，研究其表型。 3.探究斑马鱼Cldn5a、Cldn5b等在血脑脊液屏障和血脑屏障形成与功能维持中的作用。 4.研究Cldn5s与脑血管发育及脉络丛发育的关系。 方法: 1.利用免疫荧光技术检测Cldns蛋白在哺乳动物脑血管内皮细胞和脉络丛上皮细胞中的表达。通过MEGA软件构建人、小鼠、斑马鱼的Cldns的系统发育树，分析它们的进化关系。 2.通过RT-PCR、整胚原位杂交等实验检测cldn5a和cldn5b mRNA的时空表达。CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼cldn5a和cldn5b突变体。RT-qPCR实验检测cldn5a和cldn5b纯合突变体（cldn5a-/-和cldn5b-/-）的cldn5a和cldn5b mRNA表达水平，明确这两个基因是否存在表达代偿。免疫荧光实验检测Cldn5a和Cldn5b蛋白在斑马鱼脑血管内皮细胞和脉络丛上皮细胞的表达。 3.通过活体成像等方法记录cldn5a-/-和cldn5b-/-斑马鱼的表型并统计表型率。HE染色检测cldn5a-/-斑马鱼的病理改变。 4.利用RT-qPCR实验和激光共聚焦显微镜检测cldn5a-/-斑马鱼的神经炎症水平。TUNEL、免疫荧光和透射电子显微镜检测cldn5a-/-斑马鱼的神经凋亡情况。 5.使用Sulfo-NHS-Biotin和或10kDa-Rhodamine B Dextran进行血管造影以评估cldn5a-/-和cldn5b-/-斑马鱼的血脑脊液屏障和血脑屏障功能。 6.通过CRISPR/Cas9技术构建人脑微血管内皮细胞（HBMEC）和小鼠脑血管内皮细胞（bEnd.3）的Cldn5纯合突变株（Cldn5-/-）。基因测序、Western blotting、免疫荧光实验验证基因和蛋白的敲除。跨上皮/内皮电阻（TEER）实验和10kDa-FITC Dextran渗漏实验评估上述Cldn5-/-单细胞层的屏障功能。通过脂质体转染、G418筛选、单克隆挑选等方法构建稳定表达人源Cldn5的犬肾小管上皮细胞（MDCK-I）。免疫荧光验证细胞稳定过表达成功，且外源性Cldn5蛋白定位正确。TEER实验评估过表达株单细胞层的的屏障功能。 7.结合激光共聚焦显微镜成像技术、透射电子显微镜超微结构分析、RT-qPCR实验等分析cldn5a-/-斑马鱼的脑血管发育情况；通过CCK-8实验和流式细胞技术检测HBMEC和bEnd.3细胞的Cldn5-/-的增殖和基础凋亡水平。 8.通过整胚原位杂交、RT-qPCR、HE染色、透射电子显微镜分析cldn5a-/-斑马鱼的脉络丛发育。免疫荧光实验检测脉络丛上皮细胞的极性和其他细胞连接蛋白的表达。 结果: 1.Cldn5在哺乳动物脑血管内皮细胞中表达。Cldn1和Cldn3在人和小鼠的脉络丛上皮细胞表达。通过系统发育树分析及屏障功能等的系列研究表明斑马鱼cldn5a和cldn5b互为旁系同源基因，cldn5a是哺乳动物Cldn5的直系同源基因。 2.Cldn5a在斑马鱼脑血管内皮细胞和脉络丛上皮细胞高表达。而Cldn5b在斑马鱼脑血管内皮细胞中的表达水平较低。 3.约70%的cldn5a-/-斑马鱼在受精后20天~30天出现致死性脑水肿表型。少数cldn5a-/-存活时间超过30天，其主要死因也是脑水肿。脑水肿的cldn5a-/-的主要病理改变是严重的全脑水肿、脑室扩张和脑疝。脑水肿的cldn5a-/-发生神经炎症和神经凋亡。而cldn5b-/-表现为正常表型，可正常发育和繁殖。 4.Sulfo-NHS-Biotin和10kDa-Rhodamine B Dextran均可透过cldn5a-/-的血脑脊液屏障和血脑屏障，说明Cldn5a的缺失导致脑屏障功能受损。相反，Sulfo-NHS-Biotin不可透过cldn5b-/-的血脑屏障，说明Cldn5b的缺失不影响血脑屏障的功能。 5.Cldn5特异性敲除的HBMEC和bEnd.3细胞单细胞层屏障功能减弱，表现为TEER值下降和荧光素渗漏增加。而过表达人源CLDN5的MDCK-I细胞的单细胞层屏障功能增强，表现为TEER值升高。 6.Cldn5a的缺失不影响斑马鱼脑血管的发育，幼鱼期的脑血管形态及脑血管内皮细胞间的紧密连接结构正常。此外，Cldn5a的缺失不影响与脑血管发育相关的Wnt信号通路。 7.Cldn5的缺失不影响HBMEC和bEnd.3细胞的增殖和凋亡。 8.Cldn5a的缺失不影响斑马鱼胚胎和幼鱼脉络丛的发育。结合透射电子显微镜的超微结构分析表明，脉络丛及脉络丛上皮细胞间紧密连接结构不受Cldn5a缺失的影响。同时，Cldn5a缺失不影响与脉络丛发育相关的Notch和Sonic Hedgehog通路。此外，Cldn5a的缺失也不影响脉络丛上皮细胞的极性，但能导致紧密连接蛋白ZO-1的显著上调。 结论: 1.哺乳动物Cldn5蛋白在脑血管内皮细胞中表达。斑马鱼cldn5a是哺乳动物Cldn5的直系同源基因，在斑马鱼脑血管内皮细胞和脉络丛上皮细胞高表达。cldn5b是cldn5a旁系同源基因，在脑血管内皮细胞中的表达水平较低。 2.在斑马鱼胚胎受精后20天~30天时，cldn5a-/-表现为脑水肿且致死，主要病理改变是脑水肿、脑室扩张和脑疝。此外，发生脑水肿的cldn5a-/-还伴发神经炎症和神经凋亡。而cldn5b-/-可正常发育和繁殖，并无缺陷表型。 3.斑马鱼Cldn5a对血脑脊液屏障和血脑屏障的形成和功能维持至关重要。而斑马鱼Cldn5b对血脑屏障的建立与功能维持无作用。 4.斑马鱼Cldn5a对脑血管发育和脉络丛形成无显著作用，但其缺失导致了脉络丛上皮细胞间紧密连接蛋白ZO-1的上调。
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