摘要
随着我国禽类养殖业的高速发展，超级耐药菌出现等现象越发严峻，制约了禽类养殖的可持续性。因此寻找新型无害抗生素添加剂替代品，促进禽类养殖业绿色化发展成为近年来研究的热点。乳酸杆菌存在于禽类胃肠道内，具有改善肠道屏障等功能，对禽类的健康具有重要意义。生物被膜是细菌通过表面粘附生成胞外聚合物进而形成细菌膜样物，是细菌抵御不良环境的天然保护方式。目前针对病原微生物生物被膜研究较多，但关于禽源性有益微生物的生物被膜研究却处于起步阶段。 本试验分离纯化绿头鸭粪便中的乳酸杆菌，初步筛选出129株疑似乳酸杆菌菌株（T-1～T-129），经革兰氏染色、过氧化氢酶试验、抑菌试验和生物被膜形成能力测定得到7株强成膜能力乳酸杆菌(T-22、T-49、T-50、T-52、T-58、T-83和T-92)和2株弱成膜能力乳酸杆菌(T-29和T-56)。为获取生物学特性更为优良的乳酸杆菌，分别测定其产酸能力、酸碱耐受性、胆盐耐受性、胰蛋白酶和胃蛋白酶耐受性、药敏试验、溶血性试验、疏水性试验、自聚集试验、共聚试验以及生长曲线。结果显示，各株乳酸杆菌厌氧培养48h后，分离株上清液PH值在3.95～4.52；在pH=2的条件下培养4h，只有强成膜能力乳酸杆菌T-22、T-49、T-50、T-52和T-83存活；在胆盐耐受性试验中强成膜能力乳酸杆菌分离株T-22、T-50、T-83和弱成膜能力乳酸杆菌分离株T-56耐受性较好，可在0.4%胆盐中存活；在1%胰蛋白酶和1%胃蛋白酶环境培养4h，各分离株均存活，表现出良好的耐受性；在血琼脂平板培养24h后，各分离株均未呈现溶血活性；在疏水性和自聚集试验中，强成膜能力乳酸杆菌T-22疏水性和自聚集性分别为45.48%±1.12%和30.24%±0.68%，弱成膜能力乳酸杆菌T-56疏水性和自聚集性分别为47.67%±1.25%和41.71%±1.41%，分别高于其他同成膜能力分离株（P＜0.05）；在共聚试验中，强成膜能力乳酸杆菌中T-22与鸭沙门氏菌共聚能力最强可达42.7%±1.47%，弱成膜能力乳酸杆菌中T-56与鸭沙门氏菌共聚能力可达38.64%±1.12%。分别选取生物学特性更为优良但生物被膜形成能力不同的分离株T-22和T-56，经分子生物学鉴定，强成膜能力T-22为动物乳杆菌，弱成膜能力T-56为罗伊氏乳杆菌。 为更好评估强成膜能力乳酸杆菌T-22和弱成膜能力乳酸杆菌T-56益生效果，将绿头鸭随机分为H-LAB（T-22）组、L-LAB（T-56）组和Control组，分别饲喂1%乳酸杆菌T-22（1×109CFU/g）基础日粮、1%乳酸杆菌T-56（1×109CFU/g）基础日粮和基础日粮，进行为期42d的饲喂试验。在饲喂后第0、7、14、21、28、35和42d，分别采取脾脏、法氏囊、胸腺和血清样本，检测其各项免疫指数变化。结果显示，在胸腺、脾脏和法氏囊指数中，H-LAB组和L-LAB组与Control组相比均有提高且H-LAB组效果更佳（P＜0.05）；在血清相关指标检测中，H-LAB组相较于Control组血清中IgA、IgG、IgM含量增多（P＜0.05），TP和ALB含量亦提高（P＜0.05），ALT和AST含量无明显变化（P＞0.05），SOD和GSH-PX活性增强（P＜0.05），CAT无明显变化（P＞0.05）；L-LAB组相较于Control组数值略有升高但无明显差异（P＞0.05）。在攻毒保护率试验中，攻毒14d后与Control组存活率6.67%相比，H-LAB组存活率可达33.33%，L-LAB组存活率可达20%。 综上所述，本研究通过筛选获得生物学特性优良但生物被膜形成能力不同的动物乳杆菌T-22和罗伊氏乳杆菌T-56，将其制备成微生物制剂对绿头鸭进行饲喂，可有效促进绿头鸭免疫器官发育，提高免疫水平，增强抗氧化应激能力，且强成膜能力的乳酸杆菌效果更佳。这可能会为乳酸杆菌微生物制剂应用于绿头鸭养殖业提供一定理论依据。
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