摘要
本课题组前期研究发现，饮用水中亚硝胺和藻毒素高暴露可能是淮安地区食管癌高发的重要原因，亚硝胺和藻毒素可以发挥协同作用，诱导食管癌发生。随着表观遗传学的迅速发展，环状RNA(circRNA)引起了人们的广泛关注，作为潜在的分子生物标志物，circRNA在肿瘤的发生、发展中发挥了重要的调控作用。目前尚无circRNA在亚硝胺、藻毒素致食管癌中作用及机制的研究。识别circRNA在亚硝胺、藻毒素致食管细胞癌变过程中的作用及机制，将为我们理解食管癌发病机制提供新的思路，并提供潜在的诊断及治疗分子标志物。 第一章 食管癌相关circRNA筛选及分析 1、研究目的 识别食管癌中差异表达circRNA及差异表达circRNA参与调控的功能及信号通路。 2、研究方法 2.1食管癌差异表达circRNA的识别 招募100例淮安地区经病理检查确诊的原发性食管癌患者，选取3例患者的食管癌和癌旁组织，使用去线性化RNA测序识别食管癌组织中差异表达circRNA。 2.2食管癌差异表达circRNA参与调控功能及信号通路分析 利用GO富集和KEGGpathway分析差异表达circRNA参与调控的功能及信号通路。 2.3食管癌人群差异表达circRNA筛选 选取去线性化RNA测序结果中差异倍数＞2，P＜0.05的45个circRNA，分别设计Covergent、Divergent引物，利用琼脂糖凝胶电泳结合Sanger测序对候选circRNA进行成环验证。使用RT-QPCR检测经成环验证的circRNA在100对食管癌和癌旁组织中表达。 3、研究结果 3.1测序差异表达circRNA 食管癌组织中共检出571个差异表达circRNA，其中335个下调表达，236个上调表达；circRNA_12733下调表达最明显，下调倍数为77.04，Hsa_circ_0063865上调表达最明显，上调倍数为43.63。 3.2差异表达circRNA参与调控功能及信号通路 GO分析显示，差异表达circRNA主要参与了外来物质代谢、环氧化酶P450途径生物学过程。KEGG分析显示，差异表达circRNA参与调控了中枢碳代谢、化学致癌相关通路。 3.3食管癌人群差异表达circRNA Hsa_circ_0011821、Hsa_circ_0012152、Hsa_circ_0008590、Hsa_circ_0005243、Hsa_circ_0064388、Hsa_circ_0003429、circRNA_06349、circRNA_19252、Hsa_circ_0063865、circRNA_19586、Hsa_circ_0079227在食管癌人群组织中显著上调表达(P＜0.05)，Hsa_circ_0002490、Hsa_circ_0009043、Hsa_circ_0000915、Hsa_circ_0008832、Hsa_circ_0071106、Hsa_circ_0005941、Hsa_circ_0065214、Hsa_circ_0006867、circRNA_19586、circRNA_32026、Hsa_circ_0060927、Hsa_circ_0008865、Hsa_circ_0000745、Hsa_circ_0002874在食管癌人群组织中显著下调表达(P＜0.05)。 4、研究结论 食管癌差异表达circRNA可能参与调控了食管癌的化学致癌。 第二章 参与亚硝胺联合藻毒素致食管上皮细胞恶性转化circRNA筛选及分析 1、研究目的 筛选参与亚硝胺联合藻毒素致食管上皮细胞恶性转化的circRNA，评估候选circRNA在恶性转化中的作用。 2、研究方法 2.1食管上皮细胞恶性转化相关circRNA筛选 使用亚硝胺联合藻毒素染毒诱导正常食管上皮细胞(Het-1A)恶性转化，利用RT-QPCR检测筛选恶性转化细胞(Het-1A-T)细胞中异常表达circRNA。 2.2细胞中候选circRNA参与恶性转化验证 利用慢病毒转染构建候选circRNA(Hsa_circ_0006867、Hsa_circ_0063865、Hsa_circ_0071106)稳转高、低表达Het-1A细胞，使用亚硝胺联合藻毒素染毒诱导稳转细胞恶性转化，利用平板克隆、软琼脂克隆检测细胞成瘤能力。 2.3裸鼠中候选circRNA参与细胞恶性转化验证 利用裸鼠皮下成瘤、尾静脉转移瘤(小动物活体成像)实验评估稳转染毒细胞成瘤能力。 3、研究结果 3.1恶性转化相关circRNA筛选 恶性转化细胞中Hsa_circ_0006867显著下调表达，Hsa_circ_0063865、Hsa_circ_0071106显著上调表达。其中Hsa_circ_0063865、Hsa_circ_0071106随染毒代数增加呈上升趋势，Hsa_circ_0006867随染毒代数增加呈下降趋势。 3.2细胞中候选circRNA参与恶性转化验证 Hsa_circ_0006867过表达抑制、低表达促进细胞恶性转化，Hsa_circ_0063865过表达促进、低表达抑制细胞恶性转化，Hsa_circ_0071106低表达对细胞恶性转化无影响。 3.3裸鼠中候选circRNA参与细胞恶性转化验证 Hsa_circ_0006867低表达促进染毒细胞皮下移植瘤、肝脏转移瘤形成，Hsa_circ_0063865过表达促进染毒细胞皮下移植瘤、肝脏转移瘤形成。 4、研究结论 Hsa_circ_0063865和Hsa_circ_0006867参与了亚硝胺联合藻毒素致食管上皮细胞恶性转化，其中Hsa_circ_0063865发挥癌基因、Hsa_circ_0006867发挥抑癌基因样作用。 第三章 参与食管上皮细胞恶性转化circRNA功能分析 1、研究目的 识别Hsa_circ_0006867、Hsa_circ_0063865在食管上皮恶性转化中对细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡功能的调控。 2、研究方法 2.1Hsa_circ_0006867、Hsa_circ_0063865特征分析 利用RNaseR耐受实验及放线菌素D抑制实验检测Het-1A细胞中Hsa_circ_0006867、Hsa_circ_0063865稳定性，使用FISH及核、质分离实验检测Het-1A细胞中Hsa_circ_0006867、Hsa_circ_0063865分布。 2.2恶性转化细胞中Hsa_circ_0006867、Hsa_circ_0063865功能分析 利用慢病毒转染Het-1A-T细胞，构建Hsa_circ_0006867、Hsa_circ_0063865稳定高、低表达细胞。利用Transwell、Transwell+基质胶法、EdU法、AnnexinV-APC/7-AAD双染法对细胞迁移、侵袭、增殖、凋亡功能进行检测。 2.3裸鼠移植瘤、转移瘤中Hsa_circ_0006867、Hsa_circ_0063865功能分析 利用免疫组化对Hsa_circ_0006867、Hsa_circ_0063865高、低表达Het-1A-T细胞所形成皮下移植瘤、肝转移瘤、肺转移瘤中PCNA及E-cadherin蛋白表达进行检测。 3、研究结果 3.1Hsa_circ_0006867、Hsa_circ_0063865特征分析 Hsa_circ_0006867、Hsa_circ_0063865主要分布于细胞质，Hsa_circ_0006867、Hsa_circ_0063865对RNaseR耐受，内源性的Hsa_circ_0006867、Hsa_circ_0063865比线性RNA具有更好的稳定性。 3.2恶性转化细胞中Hsa_circ_0006867、Hsa_circ_0063865功能分析 Hsa_circ_0006867过表达抑制细胞侵袭、迁移、增殖，低表达促进细胞侵袭、迁移、增殖。Hsa_circ_0063865过表达促进细胞侵袭、迁移、增殖并抑制细胞凋亡，低表达抑制细胞侵袭、迁移、增殖并促进细胞凋亡。 3.3裸鼠移植瘤、转移瘤中Hsa_circ_0006867、Hsa_circ_0063865功能分析 Hsa_circ_0006867可以抑制皮下移植瘤、肝转移瘤、肺转移瘤中PCNA表达并促进E-cadherin表达，Hsa_circ_0063865可以促进皮下移植瘤、肝转移瘤、肺转移瘤中PCNA表达并抑制E-cadherin表达。 4、研究结论 Hsa_circ_0063865可以促进恶性转化细胞迁移、侵袭、增殖并抑制细胞凋亡，Hsa_circ_0006867可以抑制恶性转化细胞迁移、侵袭及增殖。
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