摘要
实验目的： 心脏纤维化在心肌肥厚、心肌梗死的进程中起着重要作用。心肌细胞肥大、炎症、细胞凋亡和心脏成纤维细胞激活与心脏纤维化有着非常密切的关系。心脏成纤维细胞是心室纤维化的关键细胞成分。心脏成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，导致大量无序的细胞外基质沉积，最终导致心肌坚硬、心功能受损。 Cdc42作为Rho GTPase家族中的一员，在生理和病理刺激中起重要作用。Cdc42通过GDP交换GTP而被激活，并与PAK1结合，进而诱导PAK1的激活，调节多个下游信号通路，调控细胞的生长、形状、运动、存活和死亡。转化生长因子-β1（TGF-β1）是一种细胞因子，它具有多种功能，它们在宿主免疫、生长发育、和炎症修复中发挥至关重要的作用。作为引起心脏纤维化的细胞因子，TGF-β发挥着重要作用。本实验室的前期工作表明，心肌细胞特异性敲除Cdc42明显减少异丙肾上腺素（Isoproterenol，ISO）诱导的心脏纤维化。本课题将探究Cdc42对心肌细胞合成和分泌TGF-β的影响及其在心脏纤维化中的作用及其分子机制。 实验方法： 1.构建心肌细胞特异性敲除Cdc42小鼠。利用Cas-9技术获取Cdc42flox/flox小鼠，与MLC-Cre（心肌细胞特异性表达的Cre重组酶）工具鼠交配得到心肌细胞特异性敲除Cdc42（F/F+）小鼠和对照组不带Cre的（F/F-）小鼠。 2.建立心脏纤维化小鼠模型，检测纤维化相关信号通路。通过皮下注射ISO建立小鼠心脏纤维化模型：选取健康状况良好的雄性小鼠（F/F+和F/F-），年龄为8-12周，把它们分成实验组和对照组。实验组皮下注射ISO（20mg/kg/day），连续7天，对照组给予注射与之等量的生理盐水，每日定点单次注射。提取造模小鼠心脏组织蛋白及RNA，分别检测与纤维化相关基因的蛋白水平及mRNA的表达；明确心肌细胞缺失Cdc42对ISO介导的心脏纤维化的影响。 3.提取原代心肌细胞，检测相关信号通路。鉴定新生小鼠（0-3天）基因型以后，提取新生小鼠原代心肌细胞，ISO（10μM）刺激24小时以后，提取细胞蛋白检测相关信号通路的变化。 4.采用不同浓度的异丙肾上腺素刺激大鼠心肌细胞（H9C2），检测其对细胞活性和细胞骨架的影响，并找到最适药物浓度。 5.细胞水平上，抑制Cdc42活性，检测心肌细胞中ISO介导的TGF-β合成与分泌的情况。采用Cdc42特异性抑制剂ML141（10μM）预处理H9C230min后，ISO（10μM）刺激不同时间，收集细胞蛋白和上清，Western Blot检测ISO对心肌细胞胞内和分泌上清中TGF-β含量的影响及其机制。 6.在细胞水平上，观察Cdc42对心肌细胞与成纤维细胞间的相互作用的影响。提取小鼠原代心肌细胞及原代成纤维细胞，探究Cdc42对心肌细胞来源的分泌物对成纤维细胞活化的影响及其机制。 实验结果： 1.10μM ISO、ML141刺激对大鼠心肌细胞细胞活性没有明显影响。ISO浓度为10μM时，大鼠心肌细胞细胞体积明显增大。 2.ISO（10μM）刺激心肌细胞后，其上清分泌物明显增加成纤维细胞Collagen I和CollagenⅢ的表达量，细胞中P-Smad2和P-Smad3的表达。而抑制心肌细胞Cdc42活性后明显缓解这一表型。 3.特异性敲除Cdc42明显减少ISO（10μM）诱导的心肌细胞合成与转录TGF-β，明显减少细胞分泌上清中的TGF-β含量。 4.Cdc42缺失或抑制其活性显著减少ISO刺激后心肌细胞或小鼠心脏组织中的STAT3、p38和PI3K/Akt的磷酸化。 实验结论： 心肌细胞特异性敲除Cdc42明显减少ISO刺激后TGF-β的胞内合成和胞外分泌，通过抑制TGF-β的经典Smads来抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，显著减轻心脏纤维化。此外，心肌细胞特异性敲除Cdc42还可能通过抑制非经典的Non-Smads信号通路介导的成纤维细胞向肌成纤维细胞转化来减轻心脏纤维化。
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