摘要
斯里兰卡木薯花叶病毒（Sri Lankancassavamosaicvirus,SLCMV）属双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金黄花叶病毒属（Begomovirus），是一种双组份的单链环状DNA病毒，由烟粉虱（Bemisia tabaci）特异性传播。由SLCMV引起的木薯花叶病（cassavamosaicdisease,CMD）是全球范围内对木薯产量影响最为严重的病害之一，已造成巨大的经济损失。自2017年以来，SLCMV已入侵我国，而我国的主要木薯品种对该病毒均无抗性。因此，相关抗病木薯品种的培育显得尤为迫切。CRISPR/Cas9作为新兴的基因编辑工具，在作物转基因育种和基因组编辑育种中发挥了重要作用。为获得抗SLCMV的木薯材料，本研究利用CRISPR/Cas9系统特异性靶向编辑SLCMV病毒基因组DNA，筛选抗病效果优良的sgRNA靶点并转化我国木薯主栽品种华南8号。主要结果如下： （1）两类单靶点CRISPR/Cas9体系构建及抗病效果检测 分别使用sgRNA在线设计工具Benchling和CRISPR-P设计了靶向SLCMV DNA-A的AC1和基因间隔区（intergenic region,IR）的sgRNA，并分别构建CRISPR/Cas9体系，以及引入Trex2和Cas9共表达的CRISPR/Cas9-Trex2体系。通过本氏烟瞬时表达实验，我们筛选出了一些可以指导CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas9-Trex2系统高效靶向编辑SLCMV并抑制病毒侵染的sgRNA。 （2）多靶点CRISPR/Cas9体系构建及抗病效果检测 为进一步发挥CRISPR系统的抗病潜力，同时降低病毒由于CRISPR干扰导致的变异逃逸风险，我们将一些有效抑制SLCMV的CRISPR靶向位点进行组合，构建了双靶点和三靶点载体并对其抗病效果进行检测和比较。结果表明，单靶点和双靶点载体均可稳定且高效地减轻植物发病症状，而三靶点载体对病毒抑制效率较低。 （3）稳定表达CRISPR/Cas9的转基因木薯株系构建 为获得稳定表达CRISPR/Cas9系统的木薯株系，我们对木薯脆性胚性愈伤组织进行了农杆菌介导的遗传转化，获得SC8木薯转基因阳性株系共42个。通过定量PCR对各株系的Cas9表达量进行检测，筛选出了Cas9表达量较高的木薯株系。在后续实验中，我们将以AsiaII1烟粉虱为SLCMV的传播介体，对转基因木薯的抗病性进行验证。 综上所述，本研究分别构建了单靶点和多靶点的CRISPR/Cas9体系并进行了抗病效果的检验，随后通过遗传转化得到了稳定表达CRISPR/Cas9系统的转基因木薯株系。本研究设计并验证了CRISPR/Cas9靶向编辑SLCMV的有效抗病性，初步验证了Trex2蛋白在提高CRISPR/Cas9系统抗病毒效果上的作用。本研究为抗病毒作物品种的培育提供了重要参考，同时也为抗SLCMV的木薯品种培育打下了坚实的基础。
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