GH43家族的系统演化分析及麦氏交替单胞菌XynZT-2基因的改造研究

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中文摘要：木聚糖酶是降解植物细胞壁的一类酶系，在工业上有广泛的用途。木聚糖酶来源于GH10、GH11、GH43等家族，由于GH10、GH11家族分子量小，空间结构简单，因此，目前对GH10、GH11家族研究广泛，GH43家族研究较少。对不同物种来源的GH43家族基因群体遗传学分析，确定其演化规律基础上，进行酶分子改造，研究重组酶与原酶酶活力差异，进而探究GH43家族基因与功能的演化关系。这种演化关系分析及木聚糖酶活性中心附近氨基酸位点的研究，对GH43家族木聚糖酶的后期改造具有指导意义。目的： 1.通过生物信息学分析确定GH43（Glycoside Hydrolase43）家族的群体演化规律及GH43家族活性中心附近的非严格保守位点； 2.通过麦氏交替单胞菌木聚糖酶XynZT-2的定点改造，探究GH43家族基因序列与其功能的演化关系。方法： 1.对GH43家族木聚糖酶基因结构域构建系统发育树，以木聚糖酶XynZT-2为例，利用MEGA对木聚糖酶基因xynZT-2进行近缘物种同源序列比对并选择突变位点。 2.通过SWISS MODEL及PyMOL对XynZT-2及其突变体进行三维建模及分析。 3.以海洋来源的麦氏交替单胞菌木聚糖酶基因为模板，运用重叠延伸PCR法，构建突变基因，对突变基因及质粒pET28a双酶切后，连接，转化至大肠杆菌，得突变菌株。对突变菌诱导得酶液，纯化后，测定突变菌株的酶学性质。结果： 1.演化：GH43基因产生于细菌、古细菌、真菌、植物分化之前，不存在动物中。 2.同源序列比对发现，不同物种来源的近源GH43木聚糖酶活性中心附近存在氨基酸差异。 3.预测木聚糖酶XynZT-2的活性中心为Asp150，Glu237，His288。找出木聚糖酶XynZT-2的5组β折叠片层保守区域附近位点，进行T28I、A33V、M97L、A102C、S148T、A152G、A238G、S239P、M241L、T287S和I291V突变，获得相应突变基因，连接至载体pET28a后，成功转入BL21（DE3），得到相应突变菌株。 4.对突变菌培养及诱导，得到11个突变酶的比酶活力。与原酶比酶活力1.068U/mg相比，6个突变酶XynZT-2A33V、XynZT-2S148T、XynZT-2A152G、XynZT-2A238G、XynZT-2S239P、XynZT-2T287S比酶活力提升，最高可提升至10.472U/mg，5个突变酶的比酶活力下降，最低可下降至0.13U/mg。 5.酶学性质检测显示：突变点T28I、A33V、M97L、A102C、S148T、A152G、A238G、S239P、M241L、T287S和I291V最适温度分别为45℃、40℃、80℃、50℃、45℃、65℃、40℃、45℃、40℃、45℃、60℃；最适pH分别为pH7.0、pH7.0、pH8.0、pH7.0、pH7.0、pH6.5、pH6.5、pH6.5、pH7.5、pH7.0、pH6.0。与原酶XynZT-2最适温度45℃及pH6.5相比，均有不同程度的改变。结论： 1.演化：GH43家族分布广，起源早，活性中心位置保守。不同物种来源的近缘GH43木聚糖酶活性中心附近存在氨基酸差异。 2.近缘物种氨基酸改变不仅引起酶活力差异，也可引起最适温度和（或）最适pH的改变。 3.系统演化规律可在保证存在酶活力基础上，用于GH43家族木聚糖酶的改造。

作者：

徐佳

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关键词：

木聚糖酶 GH43家族系统演化酶分子改造酶学性质

授予学位：

硕士

学科专业：

工程硕士(生物工程)

导师：

周晨妍、郭长江

学位年度：

2022

学位授予单位：

新乡医学院

语种：

中文

中图分类号：