摘要
蕙兰（CymbidiumfaberiRolfe）是我国传统名花，其叶姿飘逸、花香馥郁，作为国兰中香味最浓郁的盆栽花卉，栽培历史悠久，许多瓣型花品种和奇花异草广为流传，并形成了独特的赏兰和养兰文化。花是园林植物最具观赏性的器官之一，研究花器官形态建成的分子调控机制，对于观赏植物花型改良和新品种培育等均具有重要的理论意义和实践价值。前人研究表明，AGAMOUS（AG）同源基因在参与植物雌、雄蕊的发育调控中的作用和功能十分保守，其结构、表达模式和功能的变异能形成重瓣花。植物启动子区包含基因重要的转录调控元件。本研究在克隆蕙兰AG同源基因CyfaAG1和CyfaAG2基因启动子的基础上，通过启动子截断缺失体构建和活性分析，以及相应基因在蕙兰中表达的组织特异性和蕙兰花芽分化关键时期表达量的动态变化研究，探讨蕙兰CyfaAG1/2基因启动子在控制相应基因在调控蕙兰花器官形态建成中的作用和功能，为蕙兰的花型改良和种质创新积累资料。主要结果如下： （1）蕙兰CyfaAG1/2基因启动子的克隆与结构分析 用染色体步移法分别克隆到1392bp的蕙兰CyfaAG1基因的启动子pCyfaAG1（?1207/+185）和1660bp的CyfaAG2基因启动子pCyfaAG2（?1473/+187）。进一步对启动子区的顺式作用元件预测发现：pCyfaAG1和pCyfaAG2均包含AG同源基因启动子区常见的MADS-box转录因子特异性结合元件CArG-box和AP2-like转录因子特异性结合位点AACAAA-/TTTGTT-motif。pCyfaAG1和pCyfaAG2均包含多个花药、花粉特异性表达元件POLLEN1LELAT52和GTGANTG10，表明二者可能驱动相应基因参与调控蕙兰药帽和合蕊柱的发育。此外，pCyfaAG1还发现开花调控CONSTANS-like转录因子的识别和结合位点，推测pCyfaAG1可能驱动相应基因调控蕙兰开花。 （2）蕙兰CyfaAG1/2基因启动子的表达活性分析 启动子pCyfaAG1（?1207/+185）和pCyfaAG2（?1473/+187）均可以驱动GUS基因在转基因拟南芥的花序和第12期花芽的萼片、花丝、雌蕊，以及成熟花的萼片、雄蕊、雌蕊上端中表达，表明启动子pCyfaAG1和pCyfaAG2在调控基因的表达上有一定冗余，都能调控基因参与花器官发育。GUS基因在早期花芽的花药中不表达而在成熟花的花药中表达活性较高，表明启动子pCyfaAG1和pCyfaAG2驱动相应基因在花药中的表达与花药的发育程度有关。 根据不同截断缺失体驱动GUS基因在转基因拟南芥的表达部位和表达活性的不同，结合启动子区关键顺式作用元件的分布，推测启动子pCyfaAG1的核心功能区为?1203~+185bp，启动子pCyfaAG2的核心功能区为?1058~+185bp。 （3）蕙兰CyfaAG1/2基因的表达模式分析 基因的组织特异性表达分析表明：CyfaAG1基因主要在蕙兰的根、幼叶、药帽、合蕊柱和子房中表达，在萼片、花瓣和唇瓣中未检测到转录信号，其在合蕊柱中的表达量最高，药帽次之，其在合蕊柱中的表达量显著高于其它组织（LSD，P＜0.05）；而CyfaAG2基因主要在蕙兰药帽、合蕊柱和子房中表达，在其它组织中不表达，其在药帽中的表达量最高，合蕊柱中次之，其在药帽中的表达量显著高于其它组织（LSD，P＜0.05）。2个基因在同一组织的表达差异显示：CyfaAG2基因在药帽和合蕊柱中的表达量均显著高于CyfaAG1基因（LSD，P＜0.05）。 进一步分析二者在蕙兰花芽分化期表达量的动态变化发现：随着8月份蕙兰花芽的分化和药帽发育（S1期），能检测到CyfaAG1和CyfaAG2基因在花芽中明显表达；随着11月份气温降低花芽进入季节性休眠（S2期），2个基因的表达量降到最低；待翌年2月底气温回升后花芽打破休眠，重新萌动，花药中小孢子母细胞开始减数分裂时（S3期），其表达量明显升高。CyfaAG1基因的表达在单核四合花粉时期（S6期）达到峰值，直到开花当天（OF）单核四合花粉发育成2细胞型成熟四合花粉时均维持较高的表达水平；CyfaAG2基因在开花当天（OF）2细胞型成熟四合花粉时期表达量最高，在小孢子母细胞开始减数分裂时（S3期）表达量其次。2个基因在同一时期的表达差异显示：CyfaAG2基因在花药中小孢子母细胞开始减数分裂时（S3期）和开花当天的表达量均显著高于CyfaAG1基因（LSD，P＜0.05）。 综上所述：启动子pCyfaAG1和pCyfaAG2调控相应基因参与蕙兰花发育的功能有冗余也有差异，2个基因均参与蕙兰药帽、合蕊柱和子房的发育，但CyfaAG1基因主要参与合蕊柱的发育，并可能有决定花芽分化的功能，而CyfaAG2基因主要参与药帽的发育。
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