摘要
目的： 脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）可引起患者出现抑郁症状，且发病率逐年增加，严重影响患者的身心健康，亦增加家庭经济及心理负担，越来越引起临床医生的重视。SCI后导致抑郁的病理学机制尚无明确定论，且对于其临床相关治疗的报道甚少。本实验拟首先建立大鼠SCI继发抑郁行为的动物模型，探索SCI后海马重塑的病理机制，并进一步探索人参皂苷Rg1是否可改善大鼠SCI后抑郁行为及其分子机制。 方法： 1、使用动脉瘤夹夹伤大鼠T9水平脊髓建立SCI模型，20只成年雄性SD大鼠随机分为两组（n=10/组）：Sham组（只进行椎板切除术）和SCI组（脊髓夹伤）。术后约5周进行旷场试验（Open Field Test，OFT）、强迫游泳试验（Forced Swim Test，FST）及糖水偏好试验(Sucrose Preference Test，SPT)等评估大鼠的抑郁行为，Western blot（WB）检测海马caspase3表达及海马丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）三大家族信号磷酸化水平（p-p38MPAK、p-ERK1/2及p-JNK1/2）。 2、SCI大鼠侧脑室注射p38MAPK抑制剂SB203580，观察大鼠SCI继发抑郁行为的改变及海马神经炎症的变化。将40只成年雄性SD大鼠进行随机分四组：Sham组、SCI组、SCI+SB203580组及SCI+DMSO组。大鼠侧脑室注射p38MAPK抑制剂SB203580，约5周后观察大鼠SCI继发抑郁行为的改变，通过WB、免疫组化及免疫荧光等方法评估海马p38MAPK蛋白磷酸化水平，促炎因子肿瘤坏死因子-a（TNF-a）、白介素1（IL-1β），抗炎因子白介素-10（IL-10）蛋白的表达，海马神经元新生的情况，显微镜下观察海马小胶质细胞、星形胶质细胞的活化状态以及凋亡蛋白cleaved-caspase3的变化。 3、SCI大鼠腹腔注射人参皂苷Rg1，观察大鼠SCI继发抑郁行为的改变及海马神经炎症的变化。30只成年雄性SD大鼠随机分为Sham组、SCI组及SCI+Rg1组。实验组腹腔注射人参皂苷Rg1治疗，5周后进行SPT、FST及OFT等评估大鼠的抑郁行为，通过WB、免疫组化及免疫荧光等方法检测海马p38MAPK蛋白磷酸化水平，TNF-a、IL-1β、IL-10的表达及海马神经元新生的情况，显微镜下观察海马小胶质细胞、星形胶质细胞的形态变化。 结果： 1、SCI组后肢运动功能Basso Beattie Bresnahan Scale（BBB）评分较Sham组明显降低（p＜0.001）。结果提示SCI组较Sham组相比：OFT中SCI组大鼠的穿梭格子数显著减少（p＜0.01），SPT中SCI组大鼠的糖水偏好率（%SP）显著降低（p＜0.001），FST中SCI组大鼠的不动时间较Sham组显著减少（p＜0.001）。术后第三天起，SCI组大鼠体重较Sham组显著减轻（p＜0.001），直到术后第5周仍低于Sham组大鼠的体重（p＜0.001）。SCI组p38MAPK磷酸化水平较Sham组显著升高（p＜0.001），SCI组ERK1/2（p＜0.001）和JNK1/2（p＜0.05）磷酸化水平较Sham组显著降低。SCI组cleaved-caspase3的表达较Sham组显著增加（p＜0.01），提示SCI后海马可能存在神经元凋亡。JNK1/2的磷酸化水平与穿梭格子数（r=0.5442，p=0.2643）和%SP（r=-0.4007，p=0.4311）之间无相关性，OFT中的穿梭格子数与p38MAPK磷酸化水平（r=-0.8908，p=0.0172）和cleaved-caspase-3（r=-0.8555，p=0.0298）蛋白表达之间存在显著的负相关。ERK1/2的磷酸化水平与穿梭格子数之间存在强正相关（r=0.9104，p=0.0117），%SP与p38MAPK的磷酸化水平（r=-0.8946，p=0.0161）和cleaved-caspase-3的表达（r=-0.9384，p=0.0056）之间呈负相关，ERK1/2磷酸化水平与%SP之间存在强正相关（r=-0.8759，p=0.0221）。上述数据表明p38MAPK的磷酸化水平与SCI后大鼠的抑郁样行为具有相关性。 2、SCI+SB203580组较SCI组相比：SCI+SB203580组大鼠后肢BBB评分升高（p＜0.001），OFT中SCI+SB203580组大鼠的穿格子数显著增多（p＜0.01），SPT中SCI+SB203580组大鼠%SP显著增加（p＜0.001），在FST中SCI+SB203580组大鼠不动时间无明显变化（p＞0.05）。WB检测结果可见SCI+SB203580组海马TNF-a、IL-1β蛋白表达及p38MAPK磷酸化水平较SCI组显著降低（p＜0.05），cleaved-caspase3蛋白表达量显著降低（p＜0.01）。免疫荧光显示SCI+SB203580组较SCI组相比，小胶质细胞、星形胶质细胞激活受到抑制，海马的Brdu阳性细胞数显著增多（p＜0.001），而DCX阳性细胞数虽有增多，但差异无统计学意义（p＞0.05）。 3、SCI+Rg1组较SCI组相比：SCI+Rg1组大鼠后肢BBB评分显著升高（p＜0.001），OFT中SCI+Rg1组大鼠的穿梭格子数显著增多（p＜0.01）；SPT中SCI+Rg1组大鼠%SP显著升高（p＜0.001），在FST中SCI+Rg1组大鼠不动时间和SCI组无明显变化，且均较Sham组大鼠明显减少（p＜0.001）。WB分析可见SCI+Rg1组的TNF-a、IL-1β及p38MAPK磷酸化蛋白表达水平较SCI组显著降低（p＜0.05），IL-10蛋白表达水平显著升高（p＜0.05）；免疫荧光显示SCI+Rg1组较SCI组相比，SCI+Rg1组海马小胶质细胞、星形胶质细胞激活受到抑制，海马的DCX和Brdu阳性细胞数均显著增加（p＜0.05）。 结论： 1、大鼠SCI后可出现抑郁行为，模型建立成功；2、SCI大鼠海马中MAPK（即p-ERK1/2、p-p38MAPK）的磷酸化水平和抑郁行为具有显著相关性，说明SCI后海马MAPK信号磷酸化在抑郁形成中可能具有重要作用；3、p38MAPK特异性抑制剂SB203580侧脑室注射治疗后可缓解大鼠SCI后抑郁行为，抑制海马的炎症反应，促进海马神经元再生。推测大鼠海马p38MAPK磷酸化在SCI后继发抑郁行为中具有重要作用；4、人参皂苷Rg1可缓解改善大鼠SCI后抑郁行为、降低海马的炎症反应、抑制p38MAPK磷酸化水平以及促进海马神经元新生；5、人参皂苷Rg1可能通过抑制海马p38MAPK信号的磷酸化水平来改善大鼠SCI后抑郁行为。
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