摘要
肺癌是中国最常见的恶性肿瘤，并且还是全球癌症患者死亡的主要原因。其中，80%以上为非小细胞肺癌（NSCLC）。虽然近年来关于NSCLC的靶向治疗研究已经取得显著的进步，但患者的五年总体存活率仍然不足20%。末端脱氧核苷酸转移酶相互作用因子1（TdIF1）是一种与p65/NF-κB高度同源的DNA结合蛋白。它可以与末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）相互作用并调控TdT活性以参与V（D）J重组。研究者们还发现，TdIF1可以直接结合转录因子TRERF1(TRep-132)并参与转录调控。近期研究表明，核小体内的TdIF1还可以作为亚基与HDAC1/2以及TRERF1结合，形成一种新型促有丝分裂去乙酰化酶复合物（MiDAC）。MiDAC除了能够与细胞周期蛋白A结合，参与细胞周期调节外，还在肿瘤细胞有丝分裂期间的神经突发育和染色体排列过程中也起着至关重要的作用。尽管这些研究发现了TdIF1作为转录因子参与转录调控的机制，但对于TdIF1在肿瘤中的作用机制以及其作为肿瘤新型治疗分子的潜力尚未明确。本课题将系统探讨TdIF1在非小细胞肺癌中的作用并研究其分子机制，为肿瘤治疗寻找新的调控分子。 1.TdIF1在NSCLC中高表达并与肿瘤转移及患者预后相关 目的：探究TdIF1在NSCLC中的表达水平，并分析其表达水平的临床意义，明确TdIF1是否具有作为新型治疗分子的潜力。 方法：首先通过癌症基因表达数据库（TCGA）分析NSCLC患者TdIF的表达水平，进一步结合患者临床数据预测TdIF1表达的临床意义。其次利用免疫组织化学芯片来分析NSCLC患者TdIF1表达水平，结合临床病理数据分析TdIF1与患者的累积生存率的相关性。最后，收集成熟细胞株样本以及患者组织样本，通过qPCR和WB进一步验证TdIF1的表达。 结果：TCGA数据库分析发现肺鳞状细胞癌（LUSC）及肺腺癌（LUAD）患者的TdIF1表达水平较邻近正常组织更高，并且TdIF1的高表达与患者肿瘤分期相关。免疫组织化学芯片结果同样发现，相较于癌旁正常组织，TdIF1在NSCLC肿瘤组织中表达更高并与肿瘤转移相关，且TdIF1高表达组患者的累积生存率较低。qPCR及WB检测结果显示，三种NSCLC细胞株（A549、H1299、H1975）中TdIF1的表达水平均高于人正常肺上皮细胞BEAS-2B。这些结果提示了TdIF1作为NSCLC治疗分子或预后标志物的可能。 2.TdIF1调控NSCLC增殖、迁移及侵袭 目的：检测TdIF1对NSCLC生长、迁移侵袭等功能的影响。 方法：通过shRNA或siRNA敲低NSCLC细胞内的TdIF1表达。对转染后的细胞进行qPCR及WB检测分子生物学变化，通过软琼脂集落形成实验、细胞划痕实验和Transwell迁移及侵袭实验检测对应细胞生长及运动功能变化。使用shRNA构建TdIF1稳定干扰NSCLC细胞株，之后将稳定敲低组细胞和对照组细胞分别注射到随机分组的Balb/c裸鼠体内，建立NSCLC异种移植荷瘤鼠模型。在裸鼠成瘤及肿瘤生长期间，记录并比较不同实验组肿瘤生长速度，实验终点收获肿瘤组织样本进行IHC,分析生长标志物Ki-67及上皮标志物E-cadherin的表达。 结果：发现相较于对照组细胞，shRNA沉默TdIF1后的NSCLC细胞，其细胞增殖能力以及集落形成能力均受显著抑制。并且使用siRNA转染NSCLC细胞后，EMT相关分子的表达水平发生了变化。无论通过qPCR还是WB检测，其结果都出现了E-cadherin表达升高，N-cadherin及vimentin表达降低的现象。与分子变化相一致，在细胞划痕实验及Transwell迁移/侵袭实验中，TdIF1沉默组的细胞其迁移侵袭能力明显降低。体内实验结果发现相较于对照组细胞，shRNA稳转沉默TdIF1后的NSCLC细胞，其在裸鼠体内成瘤明显受抑制，形成的移植瘤明显更小，重量更轻。IHC检测两组收获的移植瘤组织后发现，相较于对照组，沉默TdIF1的NSCLC细胞形成的肿瘤内细胞增殖相关蛋白Ki-67表达水平被抑制，而上皮钙粘蛋白E-cadherin表达水平相较于对照组增高。 3.生物信息学分析TdIF1相关分子与信号通路 目的：通过生物信息学手段来分析TdIF1在NSCLC中调控的下游分子以及相关信号网络，为进一步研究其调控分子机制提供依据。 方法：将通过慢病毒构建的shTdIF1稳转细胞和对照组细胞送测Affymetrix基因表达谱芯片。根据表达谱寻找TdIF1下游差异表达基因，并对这些基因进行信号通路富集分析，筛选出富集明显的信号通路，之后通过IPA分析TdIF1相关信号网络及潜在相互作用分子。 结果：Affymetrix芯片结果分析表明：比较TdIF1沉默组细胞与对照组细胞之间的基因表达水平差异，共分析得到差异表达基因586个，其中沉默后表达上调的基因有360个，表达下调的基因有216个。对获取的586个差异表达基因进行基因富集分析，得到富集分数最高的几个通路为：Polo样激酶有丝分裂、干扰素、p53、白介素8（IL-8）和胰岛素样生长因子1（IGF-1）。值得一提的是，与上皮间质转化（EMT）相关的CDH1（E-cadherin）也是基因表达谱分析获取的差异表达上调基因。通过IPA数据库分析TdIF1信号网络，发现，除目前已知的DNTT（TdT）、TRERF1、HDAC1/2等，IPA分析同样展示了一些未曾得到验证的预测互作分子，如LSD1（KDM1A）、estrogen receptor（ER）等。以上生物信息学研究结果为后续的TdIF1-LSD1调控EMT提供了理论依据。 4.TdIF1通过LSD1参与EMT调控 目的：研究TdIF1调控E-cadherin表达的分子机制，探究其是否通过LSD1参与EMT调控。 方法：首先应用siRNA转染沉默TdIF1，使用WB检测沉默TdIF1后LSD1的表达变化，以明确TdIF1是否可直接调控LSD1。然后分别使用外源性及内源性免疫共沉淀确认TdIF1与LSD1之间是否存在相互作用。再经染色质免疫共沉淀检测TdIF1、LSD1在E-cadherin启动子的富集以及沉默TdIF1后LSD1、H3K4me2、H3K4me3、RNA聚合酶II在E-cadherin启动子的富集水平变化。使用Flag-TdIF1过表达质粒和LSD1抑制剂sp2509处理细胞并将之分为对照组、Flag-TdIF1转染组、sp2509处理组和Flag-TdIF1和sp2509联合处理组。最后对这些细胞进行染色质免疫共沉淀检测以及细胞划痕实验。 结果：TdIF1不能直接调控LSD1的表达水平，但TdIF1与LSD1之间存在相互作用。沉默TdIF1可使E-cadherin启动子区域LSD1、RNA聚合酶II富集降低，H3K4me2富集升高，H3K4me3未见显著变化。在sp2509和Flag-TdIF1的联合处理组中，相较sp2509组，LSD1富集升高而H3K4me2及RNA聚合酶II降低，而相较于Flag-TdIF1组可见LSD1降低而H3K4me2及RNA聚合酶II升高。分析划痕实验结果发现，LSD1抑制剂可以部分抑制TdIF1-OE诱导的H1299细胞迁移，同样TdIF1-OE可以部分抵消LSD1抑制剂的作用。TdIF1可通过LSD1使E-cadherin启动子去甲基化，从而参与EMT调控。 5.siTdIF1与LSD1抑制剂sp2509联用治疗NSCLC细胞EMT 目的：研究LSD1抑制剂与siTdIF1联用对NSCLC细胞生长及EMT的调控，验证沉默TdIF1与去甲基化酶抑制剂组合用药的治疗潜力。 方法：首先使用不同浓度的LSD1抑制剂sp2509处理NSCLC细胞，使用Incucyte Zoom细胞成像系统确认sp2509对NSCLC细胞生长的抑制作用。然后使用siTdIF1与sp2509作为单药或联用处理细胞，比较不同组别内的细胞生长情况。最后使用这些细胞样本进行WB检测EMT相关分子和Transwell侵袭实验检测侵袭能力变化。 结果：LSD1抑制剂sp2509对NSCLC细胞的生长抑制效果呈剂量依赖性，sp2509浓度愈高，细胞生长愈受抑制。使用sp2509和siTdIF1联合处理细胞发现，联合处理组较单独用药组的细胞的生长抑制效果更为明显。并且使用LSD1抑制剂sp2509和siTdIF1联合治疗后，E-cadherin的上调和N-cadherin、vimentin的下调较单药治疗组更为显著。siTdIF1或sp2509治疗抑制了肿瘤细胞的侵袭能力，而siTdIF1和LSD1抑制剂sp2509的联合治疗对侵袭能力抑制最为明显。
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