摘要
随着科学的进步和医学的发展，肿瘤治疗不再局限于传统的手术和化疗方法。近十年来，肿瘤靶向治疗和免疫治疗手段逐渐成熟，疗效得到了肯定，并得到学者们的广泛研究。肿瘤相关糖抗原（TACAs）作为在肿瘤细胞表面特异性表达的分子标记物，由于其具有在肿瘤的靶向治疗和肿瘤免疫方面常常被作为研究对象。纳米脂质体的粒径介于20~1000nm之间，具有类似于细胞膜的磷脂双分子层结构，使其能够通过被动靶向作用递送到肿瘤组织。并且由于脂质体载药适应性广泛且可以延长药物半衰期，在肿瘤治疗领域应用广泛。在肿瘤靶向治疗和免疫治疗方面，TACAs和纳米脂质体技术的结合可以为优化肿瘤治疗药物提供新思路。 本研究选用纳米脂质体作为药物递送系统，基于肿瘤相关糖抗原，在肿瘤靶向治疗和免疫治疗方面做了两方面研究：首先，建立纳米脂质体抗肿瘤靶向药物平台。基于肝癌细胞表面过表达的去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）的配体—Tn抗原，设计并合成了Tn抗原和磷脂共价结合的糖脂，MALDI-TOF-MS验证显示糖与磷脂的成功结合。使用合成的新型脂质体膜材包裹广谱抗癌药物紫杉醇，制备肝靶向脂质体药物。通过处方前研究确立了以15%糖脂含量的配比和薄膜分散法制备糖基化修饰脂质体。糖基化脂质体拥有74.41±0.36nm的粒径，由于肿瘤组织血管通透性高，可以借助小粒径将药物传递到肿瘤组织；15.08%±1.77的载药量使其可以携带更多有效药物；体外释放实验显示，肝靶向脂质体在48h内累计释放量为12.30%±0.33，具有缓释效应。对细胞增殖活性影响的研究中，不同细胞系经过糖基化脂质体外壳处理后细胞活力均大于80%，证明了糖基化外壳的良好的生物相容性；肝靶向脂质体显示出对肝癌细胞系HepG-2的高细胞毒作用（IC50=1.65±0.18ng/mL），与在其他细胞系中的IC50值具有显著性差异。通过共聚焦显微镜观察和定量研究细胞对肝靶向脂质体的摄取，发现HepG-2细胞对糖基化修饰的脂质体摄取量最高（荧光强度为186.46±3.16），且受到竞争性抑制剂GalNAc（Tn抗原）的抑制（预敷抑制剂后荧光强度降为66.67±2.81），证明细胞对糖基化脂质体的摄取是通过脂质体表面修饰的糖基化结构与肝癌细胞表面的ASGPR特异性识别介导的内吞作用。肝靶向脂质体药物将肿瘤细胞周期阻滞于G2/M期，并且可以导致微管蛋白α-tubulin和周期蛋白CDK1、cyclin B1的上调，证明糖基化脂质体的修饰并不影响紫杉醇本身的药理活性，反而依靠主动靶向作用增加药物的血液循环时间并发挥药效。 在成功建立纳米脂质体靶向药物平台的基础上，本课题开展了基于TACAs的肿瘤免疫治疗的研究。探索脂质体作为疫苗递送系统以及自佐剂的加入对抗原免疫原性和诱导免疫类型的影响。创新点在于采用“一釜双酶”法高效（产率98%）合成了TF抗原，NMR结果证实了酶法合成产物的准确性和纯度。将TF抗原与CRM197蛋白偶联形成糖蛋白缀合物，MALDI-TOF-MS结果显示CRM197成功偶联了约1.31个TF抗原。采用薄膜分散法制备脂质体疫苗的过程中加入了恒定自然杀伤（iNKT）细胞激活剂αGalCer作为内源性佐剂。通过对脂质体疫苗的表征证明了疫苗粒径为186.13±0.35nm，且具有高包封率（95.39%±0.04）和载药量（33.16%±0.15），证明了脂质体对半抗原的高载药效率。在6~8周龄雌性Balb/c小鼠体内进行疫苗的免疫学评价显示，脂质体疫苗的注射并不影响小鼠的体重变化证明脂质体疫苗的安全性；取免疫后的小鼠血清进行评价发现，脂质体膜载自佐剂αGalCer的疫苗可以诱导机体产生最高效价的抗TF IgG水平（均值51200）；抗体分型结果证明，即使在没有CD1d的情况下，本研究制备的脂质体肿瘤疫苗依然能诱导产生实质性的IgM反应；由于内源性佐剂αGalCer的存在，肿瘤疫苗诱导机体产生的IgG2a/IgG1的比值明显降低，而细胞因子实验中候选疫苗的高IFN-γ（均值574.60pg/mL）和IL-4因子表达量（均值160.18pg/mL）证实其可以共同促进细胞和体液免疫途径；补体依赖细胞毒实验结果证实候选疫苗由于脂质体制剂的修饰和自佐剂的加入大大提升了其对肿瘤细胞的毒性。 综上所述，本研究利用TACAs在肿瘤细胞中特异性表达的特性，以目前关于TACAs各项研究为基础，制备了肝靶向脂质体药物和脂质体肿瘤疫苗，并证明了其在肿瘤靶向治疗和免疫治疗中的高生物活性。因此，本研究在肿瘤靶向治疗和免疫治疗方面开发了新的研究思路，也丰富了肿瘤相关糖抗原在肿瘤治疗中的应用。此外，越来越多的研究证明，靶向治疗和免疫治疗的联合用药成为肿瘤治疗的新方向，本研究也为联合用药治疗手段的开发提供了前提条件。
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