摘要
细胞中DNA几乎每时每刻都遭受着损伤威胁，DNA受到损伤会导致突变产生，甚至肿瘤发生。细胞中存在DNA损伤应答机制，以保证基因组的完整性及遗传信息准确无误地传递给子细胞。DNA损伤应答包括DNA损伤修复和DNA损伤耐受等途径。跨损伤DNA合成(TranslesionDNAsynthesis，TLS)是一种主要的DNA损伤耐受途径，由一类特殊的DNA聚合酶介导损伤DNA模板的复制。Polη是其中一个主要的跨损伤DNA聚合酶，主要应对紫外线(Ultraviolet，UV)辐射引起的环丁烷嘧啶二聚体(CyclobutanePyrimidineDimer，CPD)和化疗药物顺铂(cisplatin，CDDP)引起的加合物两种损伤类型。因而，Polη与皮肤癌发生及肿瘤化疗耐药性的产生紧密相关。近年来，Polη的几种翻译后修饰，如磷酸化、泛素化、糖基化、SUMO化修饰被报道，然而，乙酰化修饰是否影响以及如何影响Polη的功能尚未见报道。 我们实验室前期通过免疫共沉淀-质谱分析的实验技术，鉴定到Polη多个潜在的乙酰化修饰位点，其中一个位点是K474。本文主要研究了PolηK474位点的乙酰化修饰对其功能的影响。着色性干皮病变异(xerodemapigmentosumvariant，XPV)细胞中Polη功能缺失，导致病人易患皮肤癌。我们首先在XPV细胞中回转了GFP-VEC、GFP-Polη-WT、GFP-Polη-K474A/R/Q表达质粒，建立了稳定表达细胞系。然后通过克隆形成实验，我们发现，与野生型相比，PolηK474Q突变使细胞对UV辐射的敏感性显著增强。同样地，细胞增殖实验(使用CCK-8试剂盒)和克隆形成实验均表明PolηK474Q突变使细胞对CDDP更为敏感。通过CPD免疫荧光实验，发现PolηK474Q突变影响Polη对CPD加合物的跨损伤合成。Foci形成实验和染色质组分分离实验结果表明，PolηK474Q突变影响Polη到UV损伤位点的招募，可能与PCNA-mUb水平降低相关。利用免疫共沉淀实验，我们鉴定到乙酰化酶CBP/p300/PCAF/MOF可能与Polη有相互作用，去乙酰化酶HDAC3/5/10可能与Polη之间存在相互作用。最后，我们成功地构建了一个内源PolηC端敲入GFP标签的细胞系，后续还将构建内源Polη-K474Q-GFP融合表达细胞系，进一步研究生理条件下PolηK474的乙酰化修饰对其TLS功能的影响。
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