摘要
LDB3是一种在不同物种中高度保守的具有PDZ-LIM结构域的蛋白，其在维持果蝇、斑马鱼和小鼠的肌肉纤维的稳定性方面具有重要功能。先前的研究在小鼠的骨骼肌中鉴定到3种剪接异构体，一种短剪接异构体(LDB3-S)，两个较长的剪接异构体（分别命名为LDB3-L和LDB3-L-Δexon10）。目前的研究主要集中在哺乳动物中LDB3基因不同剪接异构体和其编码区的突变对肌肉发育的影响，但是LDB3基因不同剪接异构体对家禽肌肉发育的功能研究尚未见报道。本研究拟通过构建LDB3基因不同剪接异构体腺病毒包被过表达载体以及特异性的干扰片段，将其分别感染和转染鸡原代成肌细胞中，以期探究不同剪接异构体在鸡原代成肌细胞中发挥的功能。另一方面，通过蛋白质免疫沉淀以及RNA-seq解析不同剪接异构体发挥不同功能的调控机制。其次将腺病毒包被的LDB3基因不同剪接异构体过表达载体注射到鸡的腓肠肌中，探究LDB3基因不同剪接异构体对鸡肌肉发育的影响。研究内容和结果如下： 1.鸡LDB3基因不同剪接异构体的鉴定 通过对AA肉鸡和卢氏鸡在E12和1W时期的样本对LDB3基因进行RACE，扩增出长度不同的5’端和3’端，根据RACE结果克隆出三个剪接异构体，将其命名为LDB3-A、LDB3-B和LDB3-C，通过反转录PCR鉴定出LDB3-A和LDB3-B是随着发育发生的可变剪接。表明LDB3在不同品种的鸡的骨骼肌中存在3个剪接变体。其中，LDB3-A和LDB3-C在胚胎期的表达量显著高于出生后(Plt;0.001)，而LDB3-B在出生后的表达量显著高于胚胎期(Plt;0.01)。在鸡原代成肌细胞中的亚细胞定位结果表明LDB3-A主要在细胞质中表达，LDB3-B和LDB3-C在细胞核与细胞质中均有表达。 2.LDB3基因不同剪接异构体调控鸡原代成肌细胞的增殖分化 本研究通过对LDB3基因不同剪接异构体分别进行过表达和干扰，检测增殖分化标志基因的RNA水平和蛋白质水平的表达量变化，并通过CCK8、EdU、流式细胞周期和MYHC免疫荧光检测LDB3基因不同剪接异构体对鸡原代成肌细胞增殖分化表型的影响。结果表明LDB3基因的不同剪接异构体均能够与CDK1和MYHC蛋白互作并通过促进或者抑制其表达进而调控鸡原代成肌细胞的增殖分化。其中，LDB3-A能够促进鸡原代成肌细胞增殖但抑制其分化，LDB3-B抑制鸡原代成肌细胞增殖但促进其分化，LDB3-C促进鸡原代成肌细胞的增殖和分化。 3.LDB3基因不同剪接异构体对肌肉萎缩的影响 通过将LDB3基因不同剪接异构体进行腺病毒包装，将其在1日龄和7日龄将腺病毒注射到雏鸡的腓肠肌中，在第13天数采集腓肠肌。进行HE染色检测不同剪接异构体对肌纤维直径的影响。结果表明，与对照组相比，LDB3-A能够抑制肌肉萎缩，肌纤维直径显著增加；LDB3-B和LDB3-C过表达能够促进肌肉萎缩，肌纤维直径显著减小。 4.LDB3基因不同剪接异构体调控肌节形成 通过在体外运用qPCR、WB、免疫荧光和蛋白质免疫共沉淀等实验技术研究了LDB3基因不同剪接异构体对于肌节的影响及其内在的机制。研究结果表明，LDB3-A能够通过结合ACTN2蛋白，抑制其表达进而减少了鸡原代成肌细胞肌节的数量，LDB3-B和LDB3-C能够通过促进ACTN2蛋白的表达进而显著增加鸡原代成肌细胞中肌节的数量。 5.RNA-seq与蛋白质免疫共沉淀质谱测序鉴定LDB3基因不同剪接异构体的分子调控机制 通过对过表达LDB3基因的三个剪接异构体进行转录组和质谱测序，鉴定到大量与肌肉发育相关的差异基因和结合蛋白，重要的是过表达LDB3-A和LDB3-B后有1497个差异基因的表达趋势是相反的。质谱测序结果表明LDB3基因的三个剪接异构体的结合蛋白和相关通路相似度较高，但三者通过不同的调控方式在肌肉发育中发挥不同的功能。 综上所述，本研究通过将LDB3剪接变体在鸡原代成肌细胞和1日龄雏鸡中过表达及一系列实验，揭示了LDB3基因不同剪接变体在鸡原代成肌细胞和肌肉发育过程中发挥的功能及其调控机制。
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