摘要
新生反刍动物在被动免疫失败或被动免疫尚未完全建立时，易受病原菌感染，导致其在新生阶段发病和死亡率较高，严重制约养殖业生产效益。初乳对新生动物的重要性已得到广泛认同，初乳中IgG可协助新生动物建立自身被动免疫，但其吸收能力受多种因素影响。目前，新生反刍动物IgG吸收分子机制尚不明晰，各类因素对其IgG吸收的影响机理尚不清楚;此外，IgG吸收对新生反刍动物肠道健康有何影响尚需进一步探究。基于上述问题，本研究以新生黑山羊为试验动物模型，旨在揭示新生反刍动物IgG吸收途径及分子机制、初乳饲喂策略对新生反刍动物IgG吸收、肠道免疫和肠道微生物的调控以及IgG吸收与肠道免疫和肠道微生物的相互关系。本文主要试验结果如下: 试验一多组学探究IgG吸收分子机制:选择16只未采食母体初乳的新生赣西黑山羊，分为两组(每组8只)，即对照组(CON，羔羊出生后4h内饲喂初乳，此时段内IgG吸收能力最强)和处理组(TRE，羔羊出生后44h饲喂初乳，此时IgG吸收效率大幅降低)。CON组和TRE组羔羊分别在出生后第12h和第52h屠宰，保证每组羔羊采食初乳后均有8hIgG吸收时间。结果显示，CON组羔羊血清中IgG水平和IgG最大表观吸收率(AEA)显著高于TRE组羔羊(P＜0.05)。免疫组化结果显示，在小肠段，空肠为新生羔羊IgG吸收的主要部位，且CON组羔羊空肠组织匀浆液中IgG含量显著高于TRE组(P＜0.05)。基于IgG吸收相关表型值和空肠mRNA转录组数据进行WGCNA分析，筛选出3个与表型显著相关的基因模块，其中M12中基因显著富集在胞吞通路。进一步分析发现，M12模块中，11个差异表达基因(DEGs)参与网格蛋白介导的胞吞作用(CME)，6个DEGs参与巨胞饮通路，暗示新生山羊肠道对初乳中IgG的吸收主要与CME和巨胞饮通路相关。随着羔羊发育时间延长，其肠道对IgG的吸收能力下降，可能与CME中参与网格蛋白合成(CLTC)、肌动蛋白相关的网格蛋白包被小泡形成(ARPCIA)、分拣内体和循环内体(CAPZA2、KIAA0196、RAB10、RAB11A和VPS35)及巨胞饮通路中参与巨胞饮小泡形成的基因(FGFR4和RhoA)表达被抑制有关。此外，miRNA转录组测序结果显示，miR-2755-3p、miR-10400-5p、miR-2944-3p、miR-71-5p和miR-2411-3p分别调控参与网格蛋白包被小泡形成(ARPCIA)、FeRn-IgG复合体分拣(VPS35)、FeRn循环(RAB10)及巨胞饮小泡形成(RhoA)的靶基因，可能参与调控羔羊肠道中IgG吸收过程。 试验二初乳饲喂时间对新生羔羊IgG吸收、肠道免疫和肠道微生物的影响:选择16只未采食母体初乳的新生赣西黑山羊，分为两组(每组8只)，即正常饲喂初乳组(NCF，羔羊出生后4h内饲喂初乳)和延迟饲喂初乳组(DCF，羔羊出生后44h饲喂初乳)。NCF组和DCF组羔羊均在出生后第52h屠宰取样。试验结果显示，DCF组羔羊血清中IgG含量及AEA均显著低于NCF组(P＜0.001)。DCF组新生羔羊空肠参与CME过程中肌动蛋白相关的网格蛋白包被小泡形成(ARPC1A)、分拣内体和循环内体(CAPZA2、KIAA0196、RAB10、RAB11A和VPS35)基因表达量显著降低(P＜0.05)。此外，DCF组羔羊血清中促炎细胞因子IL-6和TNF-α仪水平、回肠匀浆液中IFN-β含量及回肠内容物中sIgA水平显著升高(P＜0.05)。初乳饲喂时间显著影响新生羔羊回肠内容物微生物多样性，其中DCF组羔羊Chaol、Simpson和Shannon指数显著低于NCF组羔羊(P＜0.05)。PCoA分析显示，NCF组和DCF组羔羊回肠内容物微生物差异显著(P＜0.05)。LEfse分析发现，Firmicutes、Verrucomicrobia和Proteobacteria为门水平差异物种;在属水平，Clostridium_sensu_stricto_1、Clostridium_sensu_stricto_13、Caulobacter、[Ruminococcus]_gnavus_group、Epulopiscium和Akkermansia在NCF组丰度较高，Pseudomonas、Methyloprofundus、Trueperella和Escherichia-Shigella在DCF组丰度较高。回肠转录组分析发现，上调DEGs主要参与氨基酸生物合成、内质网蛋白质加工、抗原加工和递呈等过程，下调DEGs主要与溶酶体、鞘糖脂生物合成、氨基糖和核糖代谢、多糖降解、紧密连接和胞吞作用等通路相关。qPCR结果显示，延迟饲喂初乳显著上调MyD88和IFN-β基因的表达量(P＜0.05)。上述结果表明，延迟饲喂初乳降低新生羔羊对IgG的吸收能力，抑制其肠道有益菌定植,肠上皮紧密连接基因表达降低，可能损害新生羔羊肠道健康。 试验三初乳中添加甘露寡糖(MOS)对羔羊IgG吸收、肠道免疫和肠道微生物的影响:选择14只未采食母体初乳的新生赣西黑山羊，平均分为两组(每组7只)，即初乳饲喂组(CF，羔羊出生后2h内饲喂初乳)和初乳+MOS组(CM，羔羊出生后2h内饲喂初乳，MOS添加量为0.02％BW)。CF和CM组羔羊均在出生后168h屠宰取样。结果显示，初乳中添加MOS显著降低羔羊血清中促炎细胞因子IL-6水平(P=0.002)，而抗炎细胞因子IL-4水平显著升高(P=0.008)。相较于CF组，CM组羔羊血清中CAT活性显著升高(P=0.001)，MDA水平显著降低(P＜0.001)。此外，初乳中添加MOS显著提升羔羊回肠内容物中sIgA含量(P＜0.01)。PCoA分析发现，CF组和CM组回肠微生物样本显著分离(P＜0.05)。LEfSe分析显示，Firmicutes和Verrucomicrobia为门水平差异物种;在属水平，Lactobacillus在CM组丰度较高，而Akkermansia和Ruminiclostridium_5在CF组丰度较高。转录组结果显示，上调DEGs主要富集在免疫相关通路，而下调DEGs主要参与代谢过程。qPCR结果显示，CF组羔羊回肠组织中促炎细胞因子基因TNF-α和IL-6的相对表达量显著高于CM组(P＜0.05)，抗炎细胞因子IL-10的相对表达量则在CM组显著升高(P＜0.05)。此外，初乳中添加MOS后，回肠组织中紧密连接相关基因ZO-1、Claudin1和Claudin2的相对表达量显著升高(P＜0.05)。上述结果表明，初乳中添加MOS可降低新生羔羊血清炎症因子浓度，提高其机体抗氧化能力，促进肠道sIgA分泌和有益菌定植，增强肠上皮屏障功能，抑制肠道促炎因子基因表达，从而维持其肠道健康。 试验四新生羔羊IgG吸收与肠道免疫和肠道微生物关联研究:基于试验3和试验4结果，本试验主要探究IgG吸收与肠道免疫及微生物的相互关系。结果显示，新生羔羊IgG水平与Lactobacillus呈显著正相关关系(P＜0.05)，与Escherichia-Shigella、Acinetobacter和Clostridiumsensustricto1呈显著负相关关系(P＜0.05)。IgG吸收与肠道紧密连接基因ZO-1、Claudin2呈显著正相关关系(P＜0.05)，和促炎因子基因IFN-β、TNF-α呈显著负相关关系(P＜0.05)。新生羔羊IgG吸收与回肠转录组数据进行WGCNA分析共筛选出6个显著相关模块(|r|＞0.60且P＜0.01)，其中M5和M12分别与免疫和代谢相关。使用Cytoscape软件中的MCODE应用分别对M5和M12模块进行hub基因筛选，分别筛选出47和16个高连通性hub基因，其主要与胞吞作用和过氧化物酶体相关，表明IgG吸收与胞吞作用呈正相关，与过氧化物酶体呈负相关。 综合上述结果发现，随着新生羔羊发育时间延长，其空肠段吸收IgG的能力逐渐减弱，主要由于与IgG吸收相关的CME和胞吞通路中参与网格蛋白合成、肌动蛋白相关的网格蛋白包被小泡形成、分拣内体和循环内体作用及巨胞饮小泡形成的基因表达下调相关。IgG吸收减少则会影响新生羔羊肠道紧密连接、肠道微生物定植和肠道免疫发育，增加其疾病发生风险。本研究初步揭示了IgG吸收分子机制，发现了影响新生动物IgG吸收的分子靶点及IgG吸收与新生羔羊肠道健康的关联，为后续确定最佳初乳饲喂时间及初乳饲喂策略的完善提供科学依据，为IgG吸收机制的深入研究提供参考。
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