摘要
大豆是中国重要的油料作物和粮食作物，近年来，干旱、盐渍化等非生物胁迫的发生频率逐年增加，严重影响了大豆的品质和产量。中国盐碱地面积广阔，土地盐渍化问题严重。 研究表明多胺氧化酶(PAO)基因家族在棉花、黄瓜等植物中对于提高植物的耐盐性具有重要作用，但在大豆中PAO基因功能验证却鲜有报道。本课题组前期通过转录组测序筛选到GmPAO1基因，利用RT-PCR技术对该基因进行克隆并分析其基因功能。主要研究结果如下： 1.从吉农18突变体M18中克隆得到目的基因GmPAO1，该基因开放阅读框为582bp，编码193个氨基酸。荧光定量PCR结果表明，GmPAO1基因在大豆根、茎、叶、萌发的种子中均有表达，在PEG-6000、NaCl溶液胁迫下，GmPAO1基因表达量先上升后下降，推测GmPAO1基因能够响应干旱、盐胁迫并呈上调表达。 2.构建植物过表达载体pCAMBIA3301-GmPAO1和基因编辑载体pCBSG015-GmPAO1。利用农杆菌介导法和花粉管通道法，将表达载体转化到大豆受体吉农74中，获得T0代过表达阳性植株3株，CRISPR/Cas9阳性植株3株，加代后获得T1代过表达阳性植株10株，CRISPR/Cas9阳性植株8株，T2代过表达阳性植株19株，CRISPR/Cas9阳性植株14株。 3.T2代基因编辑植株测序分析结果表明，有4株株系靶点发生了编辑，KO1株系靶点1中一个碱基缺失，KO2株系靶点2中一个碱基发生了替换，KO3株系靶点1和靶点2中均有一个碱基发生了替换，KO4株系靶点2中一个碱基插入。 4.Southern blot检测结果表明，GmPAO1基因主要以单拷贝的方式整合到T2代转化植株基因组中，整合位点不同。qRT-PCR检测结果表明，T2代过表达植株GmPAO1基因相对表达量显著高于对照植株，T2代基因编辑植株GmPAO1基因的相对表达量显著低于对照植株。 5.对T2代阳性大豆种子进行NaCl胁迫处理，结果表明过表达GmPAO1基因提高了种子在盐胁迫下的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数，同时也能促进大豆侧根生长。对T2代苗期阳性植株进行不同浓度的NaCl胁迫处理，结果表明过表达株系根系发达，总根长、根体积等相关指标均极显著高于对照株系，过表达株系叶片相对含水量、叶绿素含量、SOD活性、POD活性极显著高于对照株系，MDA含量、H2O2含量显著低于对照株系，过表达株系提高了大豆耐盐性。
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