摘要
细菌作为一类重要的生防微生物资源，广泛分布于土壤、空气和海洋等不同生境中。本研究从河南省南阳桐柏山景区和山东省淄博市博山采集土壤样品，采用对峙培养法筛选拮抗活性细菌菌株，以苦瓜枯萎病菌为靶标菌进行生防细菌的筛选，并测定其对苦瓜枯萎病的防治效果；研究生防菌在苦瓜组织中的定殖能力，并优化其发酵条件；分析生防菌的代谢活性物质，并通过全基因组测序分析，探究生防菌潜在的的生防机理，评价其对苦瓜枯萎病的生防潜力。研究结果如下： 1、筛选结果表明，从不同土壤样品中分离出281株细菌纯培养，获得38株拮抗活性菌株，并从中筛选出一株苦瓜枯萎病生防细菌BF19。基于菌株的形态特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析结果，将其鉴定为美丽短芽孢杆菌（Brevibacillus formosus）。生防试验结果显示，菌株BF19对苦瓜枯萎病的盆栽和田间防效分别为66.67%和49.90%，同时，对苦瓜具有促生作用。 2、对菌株BF19进行抗生素标标记，并采用皿内双层滤纸法测定其定殖能力。结果表明，菌株BF19在苦瓜根尖的定殖密度为1.11×103cfu·g-1，同时，菌株BF19可以在苦瓜根、茎和叶片等组织中稳定定殖，接种28d后，其定殖密度高于103cfu·g-1。 3、采用单因素和正交设计试验对菌株BF19的发酵条件进行优化。结果表明，菌株BF19的最适培养基组分及含量为蛋白胨3%（g/V）。甘油2%（g/V），磷酸氢二钾0.05%（g/V）和七水硫酸镁0.2%（g/V）；最佳培养条件为接种量为2%、装液量为50mL/250mL锥形瓶、pH7.0、转速为220r/min，发酵培养时间为48h。 4、采用80%饱和度的低温乙醇沉淀法提取菌株BF19的代谢活性物质，其粗提液对苦瓜枯萎病菌的抑菌率为58.33%。活性物质对紫外线不敏感，在pH3-7、20℃-60℃的条件下，拮抗活性稳定，高温和碱性条件可降低发酵液抑菌活性。超高效液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定结果表明，菌株BF19粗提物中存在反式酰基转移酶聚酮化合物合酶衍生的抗生素（Macrobrevin）和铁载体（Petrobactin）等活性化合物。 5、采用二代Illumina NovaSeq和三代Oxford Nanopore技术相结合对菌株BF19进行全基因组测序。分析结果表明，菌株BF19基因组全长6,426,658bp，GC含量为47.23%，包含44条rRNA、127条tRNA和102条ncRNA，预测获得6017个蛋白编码基因。将编码基因在Nr、eggNOG、KEGG、GO、Swiss-Prot和CAZY等数据库注释，推测菌株BF19具有合成几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和纤维素合成酶等多种水解酶的功能；通过与枯草芽孢杆菌功能基因序列比对和结构域分析，发现BF19基因组中含有58个定殖相关基因、17个植物生长相关基因和15个诱导抗性相关的基因；通过antiSMASH6.1.0分析，发现菌株BF19基因组具有编码Petrobactin、Tyrocidine、Gramicidin和Macrobrevin等8种次级代谢活性物质的编码基因簇。
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