摘要
本文采用加压剪切联合萃取技术制备黑木耳多糖（Auricularia auricular polysaccharide，AAP），综合考虑多糖提取率和生物活性等指标，优化其工艺参数。以三偏磷酸钠（Sodium Trimetaphosphate，STMP）和三聚磷酸钠（Sodium Tripolyphosphate，STPP）为交联剂，对AAP进行磷酸化修饰，并对其结构特征及体外降血糖活性进行分析。同时以肝癌细胞（Human hepatocellular carcinomas，HepG2）为体外受体模型研究磷酸化黑木耳多糖（Phosphorylation auricularia auricular polysaccharide，PAAP）对HepG2细胞胰岛素抵抗模型的作用机制，以期为黑木耳的功能性开发提供理论依据。主要内容如下： （1）通过单因素和正交试验结合综合评分法优化加压剪切联合萃取技术制备AAP的最佳工艺。结果表明：在料液比1∶70（g/g）、反应温度110℃、反应时间60min、反应压力1.0MPa时，AAP提取率为（23.36±0.14）%、DPPH自由基清除率为（40.14±0.14）%、?OH清除率为（45.67±0.13）%，此条件下α-葡萄糖苷酶抑制率达（37.45±0.77）%，对α-淀粉酶抑制率达（21.37±0.67）%。证明AAP具有良好的抗氧化及体外降血糖活性。同时对AAP进行结构测定，超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）显示，AAP是由不同摩尔比的核糖（Rib）、岩藻糖（Fuc）、木糖（Xyl）、果糖（Fru）、甘露糖（Man）、半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glu）组成，红外光谱说明AAP具有典型的多糖特征结构。 （2）对制备的AAP进行磷酸化修饰，通过单因素及正交试验确定磷酸化黑木耳多糖的最佳工艺参数，即（STPP∶STMP）质量比5∶2、反应温度90℃、反应时间4.5h、pH9.0，此条件下制得的PAAP磷酸根含量为（8.87±0.03）%。同时对其进行分离纯化得到均一组分，命名为PAAP-1。傅里叶红外光谱显示AAP修饰后出现了磷酸基团的特征吸收峰，且PAAP-1相比于AAP相对分子质量明显降低，刚果红试验发现修饰后黑木耳多糖出现了三股螺旋结构。核磁共振光谱分析表明经磷酸化修饰后，AAP出现了磷酸基团中P的信号峰。扫描电镜结果显示相比于AAP，PAAP-1出现破碎、卷曲现象。同时，体外降糖实验结果表明PAAP-1较未修饰前AAP具有更强的体外降血糖活性。 （3）通过MTT法测定不同浓度PAAP-1对HepG2细胞活力的影响，结果显示，当PAAP-1浓度为10、25、50、100μmol/L时是HepG2细胞的安全给药范围。当胰岛素浓度为10-7mol/L时为最佳胰岛素抵抗建模浓度。PAAP-1可使HepG2细胞胰岛素抵抗模型（IR-HepG2）葡萄糖消耗量逐渐升高。同时PAAP-1可提高IR-HepG2的超氧化物歧化酶（SOD）、己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）活性（p＜0.01），对胰岛素抵抗作用引起的一氧化氮合酶（NOS）活性大幅增加现象有明显的改善效果，从而达到较好的降血糖效果。
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