摘要
大肠杆菌病是危害养鸡业常见的细菌性传染病之一，在我国鸡群中感染率可达到5%-30%，病死率高达90%，在鸡的疾病中处于首位。目前，临床上预防和治疗鸡大肠杆菌感染主要依赖抗生素，由于抗生素大量、不规范使用，导致出现耐药菌株，造成药物残留问题，危害公共卫生安全。解决上述问题最有效的方法之一就是筛选预防和治疗鸡大肠杆菌病的替抗产品。本研究拟从鸡源大肠杆菌菌株中筛选致病性较强且耐药情况较严重的菌株，以此作为宿主菌，分离与其相应的裂解性噬菌体，对噬菌体进行生物学特性及体外抑菌效果评价，为鸡大肠杆菌病的防治提供理论依据，给后续噬菌体制剂的研究做铺垫。主要研究内容如下： 1.通过对河南省部分规模化养鸡场采集病死鸡的心、脑、盲肠等，腹泻鸡的肛拭子，环境中的污水、粪便等430份样品，分离出374株阳性菌株，阳性率为86.98%。对分离出的阳性菌株进行毒力基因鉴定、耐药情况检测和血清型鉴定。结果显示，与大肠杆菌相关的17种毒力基因中，374株中有136株大肠杆菌所含毒力基因个数在10种及以上，在这些大肠杆菌中，携带tsh、cvaC、iss、iroN、iucD、irp2这6种基因中的3种及以上的基因有108株，对这108株大肠杆菌进行药敏检测，结果显示，在21种药物中，有8株大肠杆菌的耐药数量达到20种及以上，对这8株大肠杆菌的血清型分别是2株O8、2株O35、2株O76和1株O145及1株尚未确定血清型。 2.以筛选的8株大肠杆菌为宿主菌进行噬菌体的分离。对污水及粪便样品进行处理，与8株大肠杆菌共培养，采用双层平板与点滴法进行验证，对分离出的噬菌体进行纯化，测定其效价及宿主谱。结果显示，只以O145大肠杆菌为宿主菌，分离得到2株噬菌斑大小不一致的噬菌体，其他菌株并未分离出相应的噬菌体；两株噬菌体的效价分别是3×109PFU/mL、8.5×108PFU/mL，分别对两株噬菌体的宿主谱进行测定，发现两株噬菌体都具有较强的特异性，将这两株噬菌体命名为Bp1、Bp2。 3.两株噬菌体均为窄谱，由于噬菌体Bp1形成的噬菌斑较大，因此只针对噬菌体Bp1进行生物学鉴定。由透射电镜观察可知，噬菌体Bp1其头部呈六边形，尾部较长；噬菌体Bp1的MOI为0.001；通过对噬菌体Bp1生长曲线测定，发现噬菌体Bp1的潜伏期有20min左右，裂解期有50min左右；噬菌体Bp1在40℃孵育30min，60min、50℃孵育30min时仍然保持较高的生物活性，酸碱度接近7时可以维持其稳定的生物活性；噬菌体Bp1在体外环境下对其宿主菌有较好的抑制作用。 总之，筛选的鸡源大肠杆菌具有较强的致病性，耐药情况较严重；分离得到的噬菌体Bp1具有较好的裂解性，在体外环境下对宿主菌也具有较强的抑制和消灭作用，为后续噬菌体在动物体内抑菌效果评价及噬菌体制剂的研究做铺垫。
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