摘要
隐孢子虫（Cryptosporidium）是全球重要的人兽共患病原，导致人体和动物严重腹泻，影响人类健康和畜牧业健康发展。研究表明，miRNAs调节隐孢子虫感染后细胞内信号通路的激活、抗菌分子的产生、细胞因子/趋化因子的表达、以及免疫稳态的反馈调节等多个反应阶段。课题组研究显示，微小隐孢子虫（C.parvum）感染早期HCT-8细胞miR-181d表达显著下调并推测其可能参与细胞凋亡调节过程并影响C.parvum荷虫量。课题组前期已对miR-181d与B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl2）进行了互作验证，证实Bcl2分子为miR-181d靶基因。因此，本课题研究了miR-181d及其靶基因Bcl2对C.parvum感染后HCT-8细胞凋亡的影响并探索了凋亡途径，为设计开发抗隐孢子虫病药物靶标提供基础。 1.miR-181d及其靶基因Bcl2抗C.parvum感染研究 为研究miR-181d及Bcl2与隐孢子虫感染的关系，本研究检测了它们对隐孢子虫胞内增殖以及细胞凋亡的影响。试验首先构建了pcDNA3.1-Bcl2过表达载体，设计合成干扰Bcl2的特异性siRNA以及miR-181d特异性mimic（模拟物）和inhibitor（抑制剂）。利用Lipofectamine3000转染试剂分别将Bcl2过表达载体、siRNA、mimic和inhibitor及其相应对照试剂分别转染至HCT-8细胞，在转染后24h感染C.parvum子孢子，于虫体感染后2h和24h检测HCT-8细胞中荷虫量变化。qPCR检测结果显示，感染2h后各组的荷虫量均无显著变化。感染24h后，Bcl2过表达组以及miR-181d inhibitor组细胞荷虫量显著升高，而siBcl2及miR-181d mimic组细胞荷虫量显著下降。于感染后24h检测细胞凋亡，结果显示，Bcl2过表达组以及miR-181d inhibitor组细胞凋亡率均显著下降，siRNA和mimic组细胞凋亡比率均显著升高。以上试验表明miR-181d及Bcl2能够通过促进HCT-8细胞凋亡来降低隐孢子虫在细胞内的增殖，以此抵御隐孢子虫感染。 2.miR-181d及其靶基因Bcl2调控C.parvum感染后HCT-8细胞凋亡途径研究 为研究C.parvum感染宿主细胞后是否通过线粒体凋亡途径调控细胞凋亡。通过qPCR方法检测miR-181d、Bcl2及线粒体依赖凋亡途径相关分子Bax、Puma、Caspase9、Caspase3在隐孢子虫感染HCT-8细胞后不同时间点的表达，发现在感染前期（0-24h）miR-181d表达降低，Bcl2表达显著升高，感染后期（36-48h）miR-181d表达升高，Bcl2表达降低。而促凋亡分子Bax、Puma、Caspase9、Caspase3等基本与Bcl2表达呈趋势相反。使用Lipofectamine3000转染试剂将Bcl2过表达载体、阴性对照空载体、siRNA及其阴性对照、miR-181d mimic和inhibitor及其阴性对照，分别转染至HCT-8细胞，于转染后24h感染C.parvum子孢子，检测各组中Bcl2、Bax、Puma、Caspase9、Caspase3等分子的相对表达量。qPCR和WB分析结果显示，转染Bcl2过表达载体组以及miR-181d inhibitor组中在感染早期（12h）和感染晚期（48h）Bcl2的表达均显著升高，其他分子均差异性表达下降，而在siBcl2组及miR-181d mimic组分子的表达呈现相反趋势，且具有显著性。说明C.parvum感染HCT-8细胞后通过miR-181d靶向Bcl2激活线粒体凋亡途径调节细胞凋亡。miR-181d及Bcl2表达的改变可影响线粒体凋亡通路分子的表达从而影响细胞凋亡。 综上所述，miR-181d对入侵宿主细胞的C.parvum内生发育发挥重要影响。miR-181d靶向Bcl2通过线粒体凋亡途径调节HCT-8细胞凋亡，进而影响C.parvum在感染细胞中的生长发育从而抵御隐孢子虫感染。
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