摘要
新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）感染引起的禽类的一种急性高度接触性传染病。目前我国使用的ND疫苗主要是基于基因II型的LaSota株，但是目前我国流行的NDV主要为基因Ⅶ型毒株。流行株和疫苗株之间基因型不匹配导致当前疫苗保护效率低下。融合蛋白（Fusion protein，F）和血凝素-神经氨酸酶（Hemagglutinin-neuraminidase，HN）是NDV主要免疫原性蛋白和影响毒力的主要因素。在之前的研究中，我们将基因型Ⅶ型NDV的F基因和HN基因替换至Lasota株基因组中，构建了一种新型嵌合病毒rLaSota-7F/HN。替换的F基因包括含有氨基酸突变的蛋白酶裂解位点。由H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）导致的禽流感给我国养禽业造成了巨大经济损失。同时，H9N2AIV能够感染哺乳动物和人，对公共卫生安全构成严重威胁。传统的禽流感灭活疫苗和亚单位疫苗诱导的免疫反应以体液免疫为主，而黏膜免疫对于AIV的免疫是至关重要的。血凝素（Hemagglutinin，HA）是AIV的主要表面糖蛋白和主要免疫原性蛋白。在本研究中，将H9N2亚型AIV的HA基因插入到rLaSota-7F/HN的基因组中，以构建重组病毒rLaSota7-HA。评估了重组病毒对H9N2亚型AIV和NDV的免疫原性和免疫效力。论文包含以下内容： 一、表达H9N2亚型AIV流行株HA基因的重组嵌合型NDV的构建与鉴定 为开发同时防控H9N2亚型AIV和NDV的新型疫苗，将H9N2亚型AIV的HA基因插入嵌合型NDV rLaSota-7F/HN。将HA基因中类似基因终止信号序列（AGAAAAAA）进行无义突变，并在HA基因5’端添加NDV HN基因5’端非编码区序列（Non coding regions，NCR）。将NCR-HA序列插入嵌合型LaSota基因组P和M基因之间，构建了重组感染性克隆pNDFL-7F/HN-HA。在BHK-21细胞中成功拯救出重组NDV rLaSota7-HA。序列测定、Western Blot及间接免疫荧光试验结果表明，rLaSota7-HA中HA基因插入预期位置，且HA蛋白得到稳定表达。试验结果显示，rLaSota7-HA与亲本LaSota株在10日龄SPF鸡胚中的复制动态和病毒滴度相似。第28代rLaSota7-HA的鸡胚半数感染量（EID50）可达10-8.78/0.1mL。鸡胚平均致死时间（MDT）为132h，1日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）和6周龄鸡静脉接种致病指数（IVPI）均为0。本研究构建的重组病毒rLaSota7-HA为防控H9N2亚型AIV和基因型Ⅶ型NDV提供了潜在候选疫苗株。 二、rLaSota7-HA的免疫原性与免疫效力评价 为了评价重组病毒rLaSota7-HA的免疫原性与免疫效力，制备基于rLaSota7-HA的弱毒疫苗和油乳剂灭活疫苗。分别以点眼滴鼻和颈部皮下注射的方式免疫1周龄SPF鸡只。用血凝抑制试验检测抗基因Ⅶ型NDV和H9N2AIV的抗体水平。结果显示，基于rLaSota7-HA的弱毒疫苗和油乳剂灭活疫苗均可诱导抗基因Ⅶ型NDV和H9N2AIV的特异性HI抗体。攻毒及排毒检测结果显示，基于rLaSota7-HA的两种疫苗对基因Ⅶ型NDV和H9N2AIV的攻毒均可提供完全保护。因此，重组嵌合病毒rLaSota7-HA可作为同时防控H9N2亚型AIV和基因Ⅶ型NDV的廉价高效疫苗株。
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