摘要
目的: 肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是肝脏原发恶性肿瘤中最主要的病理分型，约占所有原发性肝脏恶性肿瘤的85-90%。肝细胞癌是世界上第六大常见癌症，也是癌症相关死亡的第四大原因。近年来，中国肝细胞癌的发病率和死亡率一直稳步上升。2020年，中国新增肝细胞癌患者41万人，肝细胞癌相关死亡患者39万人。由于缺乏早期特异性诊断标志物，肝细胞癌患者一旦出现症状大多数都已处于中晚期阶段，而中晚期肝细胞癌缺乏有效的治疗手段。肝细胞癌已经严重威胁中国人民生命健康。 近年来，研究人员发现Ⅲ型纤维连接蛋白结构域蛋白5(Fibronectin typeⅢstructural domain-containing protein5,FNDC5)在人体中发挥着重要的生理功能。FNDC5是一种新型运动细胞因子,能够激发白色脂肪组织向棕色脂肪组织转化。在特定的蛋白水解酶的作用下，FNDC5以鸢尾素的方式分泌到人体的器官组织中,作用于胰腺、心脏、脑、肝脏、睾丸及皮下脂肪组织等器官组织。现有研究成果证实,在人体许多组织器官中都可检测到FNDC5表达,且在多种恶性肿瘤中含量十分异常,对肿瘤的产生、进展产生不可忽视的作用,包括胃癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌等。其中，免疫组化结果显示HCC组织中FNDC5的表达呈强阳性。另外,还发现发现FNDC5表达水平的高低可以导致调节炎症反应的细胞因子水平的改变,其中就包括PYD结构域蛋3(NLRP3)。 细胞焦亡(pyroptosis)是一种区别于细胞凋亡、坏死、自噬、铁死亡的程序性细胞死亡方式。与炎症反应密切关联。涉及炎症小体形成、细胞膜上孔洞形成、促炎因子及细胞内容物释放、细胞胀大破裂等过程。大量文献证实，细胞焦亡贯穿肿瘤发生发展的全过程，广泛存在于肝癌、肺癌、宫颈癌、结直肠癌、胃癌等恶性肿瘤。细胞焦亡是一把双刃剑，既可以通过此种方式促进肿瘤细胞生长，又可以通过此种方式杀死肿瘤细胞。研究细胞焦亡在不同肿瘤中的具体分子机制，以期寻找肿瘤治疗的新方向和新靶点。 已经证实FNDC5可以促进HCC细胞的恶性增殖，细胞焦亡作为一种细胞死亡方式，也参与HCC发展的进程。但其具体的作用机制还不明了。本文构建了FNDC5过表达细胞株（FNDC5-OE）及FNDC5敲除细胞株（FNDC5-KD），观察FNDC5在不同细胞株中的表达水平差异,并检测FNDC5过表达细胞株（FNDC5-OE）及FNDC5敲除细胞株（FNDC5-KD）中细胞焦亡相关基因(NLRP3、Cleaved caspase-1、IL-1β)表达水平的变化,进一步研究FNDC5、细胞焦亡、肝癌三者之间的关系,探究具体的分子机制，为寻找HCC的早期诊断生物标志物及早期治疗靶点,提供全新的治疗思路和方案。 目的:明确FNDC5表达水平变化对肝癌细胞中的细胞焦亡相关基因表达水平变化的影响。进一步查明FNDC5在肝癌发生发展过程中的具体作用机制。 方法: 1.构建FNDC5过表达细胞株（FNDC5-OE）及FNDC5敲除细胞株（FNDC5-KD）。 2.通过Western Blot分析HepG2及SMCC7721细胞系中FNDC5过表达细胞株（FNDC5-OE）及FNDC5敲除细胞株（FNDC5-KD）中FNDC5表达水平高低。同样方法检测HepG2及SMCC7721细胞系中细胞焦亡相关蛋白(NLRP3、Cleaved caspase-1、IL-1β)的表达水平。同样方法检测加入NLRP3抑制剂后HepG2及SMCC7721细胞系中FNDC5敲除细胞株的细胞焦亡相关蛋白(NLRP3、Cleaved caspase-1、IL-1β)的表达水平。 3.通过CCK-8实验检测FNDC5表达水平对HepG2及SMCC7721细胞系增殖能力的影响,同样方法检测加入NLRP3抑制剂后HepG2及SMCC7721细胞系中FNDC5敲除细胞株增殖能力的变化。 4.通过集落形成实验检测FNDC5表达水平对HepG2及SMCC7721细胞系克隆潜能的影响,同样方法检测加入NLRP3抑制剂后HepG2及SMCC7721细胞系中FNDC5敲除细胞株克隆潜能的变化。 结果: 1.Western Blot结果显示:HepG2及SMCC7721细胞系中FNDC5过表达细胞株（FNDC5-OE）FNDC5的表达水平明显升高,FNDC5敲除细胞株（FNDC5-KD）中FNDC5的表达水平明显降低。HepG2及SMCC7721细胞系中FNDC5过表达细胞株（FNDC5-OE）的细胞焦亡关相关蛋白(NLRP3、Cleaved caspase-1、IL-1β)的表达水平明显下降,FNDC5敲除细胞株（FNDC5-KD）的细胞焦亡相关蛋白(NLRP3、Cleaved caspase-1、IL-1β)的的表达水平明显上升。加入NLRP3抑制剂可以逆转FNDC5敲除后导致的细胞焦亡相关蛋白(NLRP3、Cleaved caspase-1、IL-1β)表达水平的明显上升。 2.CCK-8结果显示:HepG2及SMCC7721细胞系中FNDC5过表达细胞株（FNDC5-OE）的增殖能力明显上升,FNDC5敲除细胞株（FNDC5-KD）的增殖能力明显下降。FNDC5敲除细胞株加入NLRP3抑制剂后,细胞株的增殖能力较不加NLRP3抑制剂组有所上升,且都呈时间依赖性。 3.集落形成实验结果显示:HepG2及SMCC7721细胞系中FNDC5过表达细胞株（FNDC5-OE）的克隆潜能明显上升,FNDC5敲除细胞株（FNDC5-KD）的克隆潜能明显下降。FNDC5敲除细胞株加入NLRP3抑制剂后,细胞株的克隆潜能较FNDC5敲除细胞株有所上升。 结论: 1.FNDC5可以抑制HepG2及SMCC7721细胞系细胞焦亡相关基因(NLRP3、Cleaved caspase-1、IL-1β)的表达。 2.FNDC5可以通过抑制NLRP3相关细胞焦亡促进肝癌进程。 小结:FNDC5可以通过抑制NLRP3相关细胞焦亡促进肝癌进程,这一特点可能为肝癌的早期诊断和治疗提供新的思路。
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