摘要
利用可再生的生物质资源生产生物燃料和生物基化工产品，是解决当今社会面临的能源、环境、资源问题的重要途径。由于果糖具有对糖尿病、肥胖症、龋齿等疾病的预防特性，因此被认为是21世纪全球代替蔗糖和葡萄糖的一种新型功能性糖来源。目前，工业合成果糖的生产工艺较为复杂、转化效率低，并且对设备要求高，在生产过程中也需要投入大量的成本。而蓝细菌是一种生长迅速、遗传背景和遗传操作相对简单的光能自养原核微生物，它可以通过太阳能将CO2和水直接转化为包括糖类物质在内的各种碳水化合物。因此，已成为将太阳能与生物技术生产相结合的替代方案。由于产品低产量和生物技术产品的商品化的经济可行性，蓝藻细胞工厂的大规模应用仍然是一项技术型挑战。 为早日实现蓝细菌光合生物制造技术的工程化应用，提高其光合合成目标产物的生产性能，本研究从打通糖类物质合成路线、阻断内源消耗以及代谢背景优化调适这三方面对底盘藻株聚球藻PCC7002进行系统代谢工程改造，打通了蓝细菌光合合成果糖的路线，实现了海洋蓝细菌利用太阳能和CO2一步合成果糖并获得高产果糖能力。此外，还通过培养条件优化，探索了高产菌株高效分泌产果糖的潜力，为进一步实现高产果糖的蓝细菌规模化培养奠定了基础。首先，通过敲除果糖激酶Fk，打通果糖光驱固碳合成与分泌的技术路线，使其有效的实现了胞内果糖向胞外的分泌，其分泌至胞外果糖含量能够达到0.64g/L。其次，在Fk缺失菌株基础上整合过量表达蔗糖合成的关键酶蔗糖磷酸合成酶Sps、蔗糖磷酸磷酸酶Spp，拉动更多碳流定向合成果糖，使胞外果糖含量达到1.98g/L,较Fk缺失菌株提高了3倍。进而在敲除果糖激酶并整合过量表达蔗糖合成关键基因的基础上敲除葡萄糖基甘油磷酸合成酶GgpS，阻断甘油葡萄糖苷GG合成途径来阻断内源消耗，同时通过过量表达关键酶淀粉蔗糖酶Ams，促进蔗糖的降解，实现胞外果糖含量的进一步提高，使其胞外果糖含量达到2.64g/L，较YD05菌株提高了1.6倍。最后，通过温度、光照强度、营养成分、补料等一系列条件进行优化，发现用MAD2培养基培养YD03藻株时的生长和产糖效果明显要优于用A+培养基培养，并且在光照强度为350μmolphotons/m2/s、温度为30℃的条件下，仅利用MAD2培养基培养高产藻株YD03便能在不采用补料的方式使其胞外果糖含量达到最高水平6.3g/L。
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