摘要
目的:血-脑屏障(Blood.brainbarrier，BBB)严重限制药物入脑，是药物治疗脑疾病疗效差的一个重要原因。大肠杆菌K1(EscherichiacoliK1，EC.K1)可通过其外膜上一系列功能蛋白，如外膜蛋白A(OutermembraneproteinA，OmpA)等，与脑微血管内皮细胞gp96受体等相互作用启动跨内皮细胞胞吞转运，从而渗透BBB进入大脑。受此启发，本论文设计了利用EC-K1外膜来模仿EC-K1入脑功能的仿生脑靶向递药策略，首先提取出去除脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)的生物相容性EC-K1外膜囊泡(Detergent-basedoutermembranevesicles，dOMV)，然后通过在基础载体聚乳酸-羟基乙酸(poly(1actic-co-glycolicacid)，PLGA)乳化法制备的纳米粒(Nanoparticles，NPs)表面包裹此细菌外膜，构建了新型脑靶向递药系统，简称为dOMV@NPs。本论文在成功建立递药系统的基础上，研究dOMV@NPs基于细菌外膜功能蛋白OmpA与BBB内皮细胞受体gp96的相互作用渗透BBB的机制，评价dOMV@NPs在正常鼠上正常脑区和乳腺癌脑转移模型鼠上肿瘤区域的蓄积效率、生物安全性、以及通过携载模型抗癌药物阿霉素(Doxorubicin，DOX)对乳腺癌脑转移的治疗效果。 方法:(1)首先通过差速离心从细菌培养上清液中提取获得天然EC-K1外膜囊泡(Outermembranevesicles，OMV)，从沉淀的细菌中通过洗脱剂脱氧胆酸钠提取dOMV;通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE)、蛋白质印迹法(WesternBlotting，WB)考察OMV和dOMV的蛋白分布与功能蛋白表达;然后利用透射电镜考察两种外膜的粒径分布和外观形态;随后采用超声乳化.溶剂挥发法制备基础载体PLGANPs，通过200nm滤膜挤出制得新型脑靶向递药系统dOMV@NPs;通过SDS-PAGE和WB考察纳米粒上负载的蛋白分布与特异性EC-K1外膜功能蛋白OmpA;利用透射电镜考察纳米粒的粒径分布和外观形态;采用马尔文粒径仪测定流体力学直径;进一步以鲎试剂终点显色法考察两种细菌外膜及所包裹纳米粒的内毒素活性;最后通过溶血实验考察两种细菌外膜及所包裹纳米粒的溶血毒性。(2)通过WB、酶标仪和Transwell体外BBB模型考察OMV和OMV@NPs、dOMV和dOMV@NPs对BBB紧密连接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1，以及BBB旁路通透性的影响;通过WB和免疫荧光表征gp96表达和定位，以及细胞摄取实验，考察荧光标记dOMV@NPs在小鼠脑微血管内皮细胞bEND.3上的摄取机制和途径;通过胞内定位及BBB模型证明dOMV@NPs具有基于OmpA的内体逃逸能力和BBB渗透能力。(3)针对dOMV@NPs的体内行为，考察了不同表面功能化包括细菌外膜包裹和红细胞膜(Redbloodcellmembrane，RBCM)包裹等对巨噬细胞吞噬纳米粒的影响;考察荧光标记dOMV@NPs的小鼠体内药代动力学行为;通过小动物活体成像系统和电感耦合等离子体质谱(Inductivelycoupledplasmamassspectrometry，ICP-MS)考察dOMV@NPs在小鼠体内脑内蓄积;通过脑组织免疫荧光从微观角度考察dOMV@NPs在小鼠不同脑区分布以及与各种类型脑细胞的定位情况;通过WB和细胞摄取实验考察神经元细胞HT22上的gp96表达和对dOMV@NPs的摄取。 结果:(1)dOMV的产量(2.0mg蛋白/L菌液)远远高于OMV的产量(0.58mg蛋白/L菌液);OMV和dOMV二者均高表达EC-K1外膜功能蛋白OmpA，但二者在其它蛋白分布方面略有差异;透射电镜下两种外膜囊泡呈现不规则椭圆球体结构;对细菌外膜包裹纳米粒的理化性质表征结果证明，通过挤出成功将OMV和dOMV两种外膜转移至基础载体PLGANPs表面:透射电镜下纳米粒显示出壳-核结构;与未包裹的基础载体PLGANPs相比(109.5rim)相比，细菌外膜包裹后纳米粒粒径略有增加，OMV@NPs和dOMV@NPs流体力学直径分别为119.5nm和119.3nm。上述结果证明了新型脑靶向递药系统dOMV@NPs的成功制备。进一步的鲎试剂终点显色法和溶血实验表明，相比于LPS、OMV以及天然细菌外膜包裹的OMV@NPs，dOMV及dOMV@NPs未引起明显内毒素活性和溶血毒性，更具生物相容性。(2)研究dOMV@NPs渗透BBB的机制。首先，相比游离LPS、OMV及OMV@NPs显著下调体外培养的bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞问紧密连接蛋白claudin-5、occludin和ZO-1的表达，dOMV和dOMV@NPs未下调这些蛋白的表达;进一步地，LPS和含有LPS的OMV都显著提高了FITC标记右旋糖苷(40kDa)的BBB渗透效率，相反OmpA重组蛋白和dOMV都未改变FITC标记右旋糖苷的BBB渗透效率;dOMV@NPs可被bEND.3细胞高效摄取;OmpA和dOMV@NPs可促进bEND.3细胞上gp96的表达，gp96主要定位于bEND.3内皮细胞的胞质和细胞膜;OmpA特异性抗体和gp96特异性抗体将bEND.3细胞上dOMV@NPs的摄取分别抑制了36.5％和44.1％;dOMV@NPs在bEND.3细胞上的摄取涉及脂筏途径、小窝蛋白介导胞吞以及巨胞饮等;随着时间增加，红色荧光标记的dOMV@NPs与bEND.3细胞内体(绿色荧光标记)共定位显著降低，证明dOMV@NPs具有内体逃逸能力;体外血.脑屏障模型上dOMV@NPs可高效渗透BBB，～3.73％的dOMV@NPs和～3.78％的OMV@NPs成功穿过BBB到达基底侧，显著高于未包裹基础载体PLGANPs和低密度脂蛋白受体相关蛋白1(Lowdensitylipoproteinreceptor-relatedprotein1，LRP1)靶向的Angiopep-2多肽修饰的NPs(A-NPs)。(3)研究dOMV@NPs在正常小鼠上的脑部蓄积。相比OMV@NPs和红细胞膜包裹纳米粒(RBCM@NPs)，dOMV@NPs可更高效逃逸RAW264.7巨噬细胞的吞噬;相较于游离模型近红外荧光探针IR780，IR780标记的dOMV@NPs/IR780在小鼠体内具有更好的药代动力学行为，延缓了血液中的清除，如曲线下面积提高(Areaunderthecurvefromzerototimet，AUCO→t)，平均停留时间更长(Meanresidencetimefromzerototimet，MRT0→t)，血液循环半衰期(Halftime，t1/2)更长以及清除率(Clearance，CL)更低;IVIS小鼠活体成像结果显示，dOMV@NPs在大脑中的荧光强度显著高于A-NPs和RBCM@NPs，具体地，尾静脉注射8小时后dOMV@NPs的颅内蓄积为A-NPs的1.73倍，24小时为A-NPs的1.48倍;ICP-MS结果显示，与未给药小鼠相比，负载SPIO的RBCM@NPs、A-NPs和dOMV@NP处理的小鼠颅内铁浓度分别增加了0.788mg/kg、3.28mg/kg和7.25mg/kg，gp96特异性抗体的预处理显著降低了SPIO标记dOMV@NPs导致的颅内铁浓度的增加;进一步的定量结果显示dOMV@NPs在每克脑组织中的蓄积率达到注射剂量的1.11％;脑组织切片结果显示，共聚焦显微镜下在前额叶皮层、纹状体、海马和黑质这些大脑区域未发现红色荧光标记的RBCM@NPs的蓄积，在前额叶皮层、海马和黑质中可以观察到红色荧光标记的A-NPs，而dOMV@NPs在这四个颅内区域具有显著且高效分布，效率显著高于A-NPs;HT22神经元细胞高表达gp96并可高效摄取dOMV@NPs;大部分dOMV@NPs定位于脑组织细胞间隙，与各类型脑细胞(包括神经元)共定位率极低。 结论:本论文成功构建了基于去除LPS的生物相容性EC-K1细菌外膜的新型脑靶向递药系统dOMV@NPs，可通过外膜功能蛋白OmpA与BBB内皮细胞受体gp96相互作用的介导跨内皮细胞转运途径穿透BBB。本论文证明了该脑靶向递药系统具有高效渗透血-脑屏障和靶向递药入脑的能力、良好的生物安全性、以及脑转移瘤靶向性和应用于乳腺癌脑转移临床治疗的潜力;该策略的提出也为实现高效的脑靶向递药及脑转移瘤靶向递药提供了新的研究思路和理论基础。
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