摘要
柑橘黄龙病（CitrusHuanglongbing，HLB）是由革兰氏阴性细菌-韧皮部杆菌侵染引起的柑橘毁灭性病害，我国主要为亚洲种韧皮部杆菌（''CandidatusLiberibacterasiaticus''，CLas）。该病给全球柑橘产业造成巨大经济损失。 柑橘黄龙病目前尚无根治措施，抗病分子育种是未来遏制该病害的主要手段之一。研究显示，WRKY基因在抗病/虫过程中起关键作用，但柑橘WRKY基因响应CLas侵染和木虱取食尚不明确。因此，本研究鉴定了克里曼丁橘和甜橙基因组中WRKY基因，通过多样本多时间点转录组学分析筛选柑橘响应CLas侵染和木虱取食的WRKY基因，并通过RT-qPCR进行表达量分析验证。以明确柑橘黄龙病菌侵染和木虱取食引发的WRKY基因响应，进而为解释CLas侵染和木虱取食触发寄主防御反应提供了一定的理论依据，也为后续WRKY基因功能研究提供了可靠的候选基因。主要研究结果如下： 1、通过筛选木虱叮咬和黄龙病染病样品内参基因，明确了两个稳定表达基因ECR1和UPF0121可用于后续定量PCR分析； 2、基于WRKY基因家族分析和转录组数据筛选响应CLas侵染和木虱取食差异表达候选基因，进一步通过RT-qPCR验证明确了CsWRKY1感黄龙病后显著下调，CsWRKY5显著上调表达；木虱取食柑橘后CsWRKY15，CsWRKY26，CsWRKY10，CsWRKY37均显著上调表达，而CsWRKY43则下调表达。同时发现，CsWRKY47在CLas侵染和木虱取食样品中均极显著上调表达。预示着WRKY家族基因在响应CLas侵染和木虱取食过程中可能有着重要的生物学功能。 3、本研究优化了Ccl-eEF1a启动子和CsUAP56小内含子，构建了适用于柑橘和豇豆瞬时转化的亚细胞定位载体pHCi12C，该载体已优化消除了所有GoldenGate克隆常用酶切位点，可将候选基因通过双BsmBI酶切位点定向插入mEGFP基因3’端；同时载体内设计了核定位tdTomato内部参照，可直接准确地评判候选基因是否定位在细胞核。 4、对筛选出的差异表达WRKY基因进行了亚细胞定位研究。结果显示，CsWRKY10、CsWRKY26、CsWRKY40、CsWRKY41与mEGFP的融合蛋白定位于细胞核中；CsWRKY15和CsWRKY47与mEGFP的融合蛋白定位于细胞核和细胞膜，而CsWRKY15除定位于细胞核和细胞膜外，还定位于细胞器内，但目前尚不能确定所定位的细胞器的类型，需进一步使用tdTomato连接不同的细胞器定位信号来进一步确定具体的定位信息。这些结果说明候选的CsWRKY转录因子亚细胞定位不同，预示着他们在细胞内行使的功能可能有差异。
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