摘要
抗性基因（ARGs）作为一种新型环境污染物，其危害在于可以通过水平基因转移（HGT）的方式使致病菌获得抗性，从而导致抗生素的失效，严重危害人类健康。近年来，为了防治畜禽疾病，抗生素和重金属常作为饲料添加剂被大量用于规模化畜禽养殖业中，导致畜禽粪便成为抗生素、重金属及ARGs的重要蓄积库。厌氧消化技术是实现畜禽粪便资源化利用的处理途径之一，但目前有关抗生素和重金属污染环境下畜禽粪便厌氧消化过程中ARGs的赋存特征和迁移转化机制的研究仍不清晰。因此，本论文系统地开展了的猪粪厌氧消化处理过程中ARGs的归趋与控制的研究，以揭示抗生素和重金属压力对猪粪厌氧消化产甲烷过程的影响以及ARGs赋存特征的生物学机制。并针对抗生素和重金属残留的猪粪厌氧消化过程中重金属钝化效果差、消化系统不稳定、ARGs扩散等问题，通过投加秸秆生物炭（BC）和KH2PO4改性生物炭（BP）改良消化工艺，以期实现在强化猪粪厌氧消化处理效果的同时进一步减轻由重金属、抗性基因扩散所造成的生态风险。 论文首先研究了抗生素残留对猪粪厌氧消化过程及ARGs的影响，考查诺氟沙星（NOR）和磺胺甲恶唑（SMZ）单独及复合污染时对猪粪厌氧消化过程中的抗生素、甲烷产量、微生物群落组成、抗性基因丰度等各项指标的影响，解析抗生素选择性压力对猪粪厌氧消化过程中ARGs迁移转化的作用机制和关键因素。研究发现，SMZ和NOR在泥相和水相中的降解规律存在较大差异，SMZ在消化过程中的降解速率较快，且NOR和SMZ共存时抗生素的降解速率比单独投加时更快。NOR和SMZ均会对产甲烷过程产生负面影响，NOR抑制了厌氧消产气并增加了产甲烷延滞期，SMZ对产甲烷过程影响较小，但会明显增加产甲烷延滞时间。NOR和SMZ存在的情况下，aac(6'')-Ib-cr，sul1和sul2等ARGs的基因丰度升高,抗生素的存在也会增加ARGs发生水平基因转移的风险。抗生素会降低厌氧消化系统中微生物的丰富度，但SMZ可以促进Methanospirillum，Methanobacterium和Methanosarcina等氢营养型产甲烷菌的生长。抗生素存在环境下，各种因素对ARGs的影响程度的大小依次是微生物群落结构（43.4%）＞intI1（14.4%）＞环境因子（7.3%）＞重金属抗性基因（MRGs）（4.8%），微生物群落结构的演替对ARGs的迁转起到了主导作用。 论文随后考察了重金属残留对猪粪厌氧消化过程及ARGs的影响，解析了重金属（Cu和Zn）选择性压力对猪粪厌氧消化过程中ARGs迁移转化的作用机制和关键因素。研究发现，Cu和Zn存在时，对厌氧消化产气有一定的抑制作用，但重金属的存在缩短了产甲烷的延滞期。消化过程对Zn有较好的钝化效果，消化结束后系统中不稳态锌的占比显著降低。厌氧消化过程可以降低系统内大多数ARGs的基因丰度，ARGs的去除效率为20%-90%。但重金属存在时，消化过程中总抗性基因、ARGs和可移动基因元件（MGEs）的丰度均有明显增加，外源重金属压力会显著增加抗性基因发生水平转移的风险。重金属的存在对厌氧菌群结构的影响有限，微生物的群落结构保持在一个相对平衡的状态。重金属产生的选择性压力可以直接影响ARGs，且重金属通过改变MGEs和水平基因转移又间接的对ARGs产生影响。重金属存在环境下，intI1对ARGs的迁转具有显著的直接影响（R=0.85，p＜0.01）。因此，外源重金属压力下，可以通过降低MGEs的丰度或钝化重金属来降低消化系统中ARGs迁移转化的风险。 在前面研究结果的基础上，提出基于BC和BP投加的厌氧消化改良工艺，探究生物炭对猪粪厌氧消化过程及ARGs的影响。研究发现，BC和BP的添加强化了厌氧微生物间的种间电子传递过程，显著提高了消化系统的甲烷的产量并缩短了产甲烷延滞时间。生物炭可以充当电子导线实现远距离的电子转移，减轻或替代了微生物对细胞色素C（cyt-c）的需求，因此降低了系统中cyt-c的含量。添加生物炭后丰富了消化系统的产甲烷途径，Methanothrix可能与Defluviitoga，Thermovirga以及Cloacibacillus通过种间直接电子传递（DIET）的方式耦合产生了甲烷。BC和BP的添加均降低了消化系统中DTPA可提取态Cr、Cu、Pb和Zn的含量，促进Cr、Cu、Pb和Zn转化成更为稳定的状态，并相应地降低了这些重金属的生态风险等级。BP析出的磷酸盐可以与Cr、Cu和Pb形成多种金属磷酸盐沉淀从而加强了重金属的钝化效果。但磷酸盐引入消化系统后会引起As(Ⅲ)的释放，从而增加了As的可生物利用度和毒性。添加生物炭后进一步削减了消化系统中的抗性基因，eARGs的变化主要与生物炭的吸附及MGEs的变化相关，具有较大的比表面积的生物炭BP有更好的eARGs吸附效果，而iARGs的变化主要与胞内16SrRNA和潜在宿主菌相关。在消化系统中添加生物炭后，微生物产生氧化应激反应，增加了细菌抗氧化系统的水平，并通过DNA损伤诱导微生物产生DNA损伤修复（SOS反应）。细菌抗氧化水平的升高导致细胞膜受损加剧，不完整的细胞膜结构进一步对细菌的能量代谢过程产生负面影响。这些改变最终都会引起消化系统内胞外抗性基因和胞内抗性基因的改变以及ARGs水平转移频率的变化。添加生物炭的能够弥补厌氧消化工艺的不足，显着提高消化效率，极大的减轻了由重金属和抗性基因扩散所造成的生态风险。
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