摘要
现阶段，由于化石燃料的价格波动及其开采过程产生的环境污染问题，具备绿色、环保且可替代功能的生物燃料已经成为全球各国发展可持续性经济的共同需求。在众多的生物燃料中，生物丁醇因其具有热值高，安全性高，污染小，低腐蚀性便于管道输送，能与汽油以任意比混合等优点，有望在替代化石燃料过程中发挥重要作用。生物丁醇的生产通常由产溶剂梭菌经ABE（Acetone-Butanol-Ethanol，丙酮-丁醇-乙醇）发酵途径产生。然而，传统的生物丁醇发酵工艺主要面临着原料成本高、丁醇收率低等问题，严重阻碍了生物丁醇生产的工业化进程。 廉价生物质底物的开发和有效利用是提高丁醇发酵工业应用价值的途径之一，而近年来，海洋大型藻类如红藻中因富含大量琼胶多糖成分，能够释放可发酵糖类，具备作为底物转化生物丁醇的潜力。但由于产溶剂梭菌缺乏类似琼胶酶等水解酶，因此无法有效直接利用这些多糖物质进行丁醇转化，因此通过代谢工程来改造菌株促进其利用藻类多糖成分，提高丁醇产量，降低发酵成本，最终实现生物丁醇的工业化生产迫在眉睫。基于此，本论文围绕实验室前期筛选保藏的一株优势产溶剂梭菌Clostridiumsp.WK展开相关工作。首先，通过基因工程技术构建基于梭菌的琼胶酶系分泌型表达载体，经电转化和重组子筛选验证获得具有琼胶酶活性的工程菌株WK-A1和WK-AN1。其次，经卢戈氏染液活性染色定性实验和酶活定量测定分析进一步验证功能菌株的产酶能力，通过优化发酵条件确定最优丁醇发酵体系是以10g/L葡萄糖和15g/L琼脂作为混合碳源。最后经对比分析，在相同的分批发酵培养体系，工程菌株WK-A1和WK-AN1菌相较野生菌株WK表现出更好的利用琼胶多糖发酵丁醇的性能，其中菌株WK-AN1的丁醇产量及发酵性能显著高于菌株WK-A1，说明新琼二糖水解酶NH2780在促进琼胶多糖释放更多可发酵底物的过程中发挥重要作用。发酵结果显示，在上述体系中，工程菌株WK-AN1的丁醇产量（5.9g/L）相较野生菌（2.6g/L）提高了127%，转化效率也由10%提高到了24%，实现了产溶剂梭菌菌株直接利用琼胶多糖发酵生物丁醇的过程，初步为利用海藻生物质工业化生产生物丁醇的这一新途径提供前期数据支持。 另外，本论文通过建立基于CRISPR-dCas9基因编辑技术的产溶剂梭菌体系，成功实现了对消耗还原力的NADH-醌氧化还原酶亚基G基因（nuoG）的表达进行靶向抑制，通过调节菌株体内还原力水平进一步促进菌株产溶剂的水平。首先，将构建成功的基因转录抑制质粒pCRISPR-nuoG经电转导入野生型菌株WK，结合PCR验证及突变株筛选最终获得改造菌株WK-dCas9-nuoG。利用RT-qPCR方法对靶向基因nuoG的转录水平进行测定分析，结果显示该菌株对基因nuoG的转录水平抑制效率可达37%。其次，在以30g/L葡萄糖为碳源的培养条件下，对野生菌株WK和改造菌株WK-dCas9-nuoG胞内还原力水平以及ATP当量进行分析，结果证实改造菌株胞内的还原力水平和ATP当量均明显高于野生菌株，其中改造菌株在产溶剂期48h还原力NADH水平比野生菌株高72.1%，ATP含量高42.3%，相关结果均说明经基因定点编辑的nuoG基因的转录水平得到明显抑制，其胞内还原力水平也维持在较高水平，有利于溶剂的合成。最后，在丁醇分批发酵实验结果同样显示，改造菌株WK-dCas9-nuoG相较野生菌株WK在丁醇产量方面提升了10.9%，且总ABE溶剂产量也提高15.6%，在成功赋予菌株更加优良的产溶剂能力的同时，也成功搭建基于产溶剂梭菌基因编辑平台，这为后续靶向抑制其他代谢途径及定点调控梭菌代谢流奠定平台基础。 综上所述，本论文主要围绕调控新型产溶剂梭菌Clostridiumsp.WK的代谢流，并逐步实现提高其利用琼胶多糖转化生物丁醇的效率，一方面利用梭菌特异性分泌表达体系实现琼胶酶系的胞外表达，加速琼胶多糖到丁醇转化速率，另一方面通过基因编辑技术靶向抑制nuoG基因转录，提升胞内还原力水平进一步提高发酵产物的产量。因此，本论文通过构建一系列新型工程菌，不仅实现琼胶多糖的生物能源转化过程，建立并促进海藻生物质的可持续利用，也将为进一步拓展产溶剂梭菌的分子改造，优化代谢途径提供有效的理论基础和数据支撑。
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