摘要
目的：肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是一种发病率和死亡率很高的疾病，严重危害人类健康。尽管目前肝癌的诊疗已有长足的进步，但由于其转移复发率极高，患者预后较差，目前临床上仍缺乏其有效的诊断和治疗靶点。因此，进一步探索肝癌复发转移的具体机制将有效提升肝癌临床诊断和治疗效果。随着转录组学的快速发展，不少研究表明在肝癌组织中存在调控复发转移且异常表达的关键分子，在肝癌发生、发展中扮演重要角色。 课题组前期通过高通量芯片筛选得出ASRGL1这一肝癌转移复发相关的关键基因，并在公共数据库上对其表达和预后进行验证，进而通过体内、体外实验深入探究其在肝癌侵袭、转移、增殖等的重要作用与机制，为ASRGL1作为肝癌转移复发治疗靶点提供坚实的理论依据。 方法：1.收集我院术后1-2年内复发样本（易复发组）和术后5年内不复发样本（不易复发组）各4例经高通量基因表达谱芯片进行检测，通过分析得到易复发组和不易复发组差异表达最为明显的候选基因ASRGL1；通过对公共数据库（TCGA和OEP000321）肝癌和癌旁组织进行分析，验证其在癌和癌旁的差异表达。并结合临床病例信息作相关性分析，通过Kaplan-Meier法分析ASRGL1与预后（无瘤生存期和总体生存期）的关系。 2.收集12对肝癌及其对应癌旁组织，使用Trizol法提取组织RNA，普通PCR对ASRGL1基因进行扩增，核酸琼脂糖凝胶电泳对转录水平进行验证；使用免疫组化验证肝癌及其癌旁组织中目的蛋白表达情况。 3.使用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测7种肝癌细胞系ASRGL1基因的表达水平。 4.在上述细胞系中筛选相对低表达的细胞系构建稳定过表达细胞株通过转染siRNA在相对高表达的细胞系中敲低ASRGL1基因。通过平板克隆、CCK-8以及Transwell分别验证ASRGL1基因对增殖和迁移的影响；使用流式检测目的基因对细胞凋亡的影响。 5.体内使用小鼠皮下瘤模型验证ASRGL1基因对成瘤能力和肿瘤生物学行为的影响。 6.使用RNA-seq技术对ASRGL1基因过表达和对照细胞系进行测序，分析得到差异表达基因，进行GO、KEGG和GSEA富集分析挖掘其下游影响通路。 7.使用qRT-PCR和流式验证RNA-seq的重要结果，并获得ASRGL1的下游上调基因。 8.使用WesternBlot验证富集分析所提示的下游潜在通路。 9.使用CIBERSORT分析ASRGL1对免疫细胞浸润的影响。 10.构建并验证稳定过表达Asrgl1的小鼠肝癌细胞系Hepa1-6，构建皮下瘤模型验证免疫细胞浸润水平。 结果：1.高通量芯片结果提示ASRGL1为易复发组和不易复发组中差异表达最为明显的候选基因之一。在TCGA、OEP000321数据集分析及临床样本检测均发现ASRGL1在肝癌组织中明显高表达；在Huh7细胞系中高表达，而在Bel-7405细胞系中相对低表达。 2.在细胞学实验中，ASRGL1被敲低后，发现肝癌细胞增殖、迁移能力减弱；反之亦然，过表达ASRGL1后肝癌细胞增殖、迁移、抗凋亡能力增强。在裸鼠皮下成瘤实验中发现过表达ASRGL1能促进肿瘤生长。 3.RNA-seq结果显示CD36为ASRGL1下游潜在基因，并经qRT-PCR和流式细胞术分别验证。 4.ASRGL1可能与ECM?receptorinteraction通路相关，并可能通过上皮间质转化（EMT）途经影响肝癌的进展。 5.此外，CIBERSORT显示ASRGL1与巨噬细胞的浸润水平呈正相关，动物实验结果也提示高表达的Asrgl1可在小鼠肿瘤和外周血中招募巨噬细胞。 结论：1.ASRGL1可促进肝癌细胞的增殖、迁移和凋亡，并通过CD36影响肝癌细胞发生EMT。 2.ASRGL1可招募巨噬细胞影响肝癌免疫微环境，从而促进肝癌进展。
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