摘要
大型藻类作为第三代生物质的主要组成部分，因其物种丰富，可再生且富含碳水化合物的特性，在生物能源和高价值化学品转化方面具有巨大的开发潜力，能有效解决化石燃料消耗带来的环境污染和资源枯竭等问题。而作为生物燃料代表，生物丁醇与已作为汽油添加剂的生物乙醇相比，其能量值更高，吸湿性和腐蚀性更小，且能与现有的油气管道和汽车发动机更为兼容，已经被视为是替代化石燃料的最佳选择之一。同时，被广泛应用于橡胶、药物和航空燃油的高价值化学品原料——2,3-丁二醇（2,3-BDO）也在近年来因其需求量暴涨而备受关注。与传统化学合成手段相比，通过采用生物合成方法生产能源物质可以避免石油快速消耗及环境污染的问题，与现阶段要求的能源开发可持续性要求一致。基于此，本论文选取大型藻类——石花菜（Gelidiumamansii）作为海洋生物质能开发的代表，通过建立和优化酸预处理方式，并利用实验室前期分离获得的一株优势产溶剂梭菌Clostridiumsp.WK，建立利用石花菜有效发酵生物丁醇的体系，并在此基础上尝试利用过表达技术实现在该菌株中合成丁二醇的过程，在降低丙酮等副产物产量的同时，大幅提升菌株的底物转化效率，为实现工业化海藻生物质生产生物丁醇提供数据支持。 首先，本论文通过温度、水解时间和酸浓度等三个方面探索和优化利用稀硫酸处理石花菜的最佳条件。通过使用响应面法（RSM）分析了不同条件之间相互作用以及对生物质水解的影响，建立相关模型以获得最佳稀硫酸水解条件。实验结果表明，当水解温度为131℃，水解时间为20min以及硫酸浓度为2%的条件下，石花菜的最高水解率可达80.95%。在此条件下，通过接种产溶剂菌株WK，可有效利用该水解液进行丙酮-丁醇-乙醇（ABE）发酵，最终产生3.46g/L丁醇，产率为0.20g/g还原糖，相较于菌株利用未经处理石花菜的过程，该处理过程将转化率显著提高了12.5倍。 其次，结合前期对菌株WK的丁酸盐重吸收机制的研究结果，本论文也在上述酸处理的基础上，首次建立了一种基于丁酸处理石花菜并应用于生物丁醇转化的技术体系。实验结果表明，当料液比固定在1:10时，温度设定为131℃，采用28.8g/L丁酸的条件下，石花菜的水解率达到25.11%，而在料液比调整为1:5时，利用96.0g/L丁酸，可进一步将水解率提升至27.43%。该丁酸水解液只需经过一定比例稀释后即可直接作为菌株WK的发酵底物，在经168h发酵后丁醇产量最高可达4.45g/L，产率0.27g/g还原糖。该体系的优势在于水解液只需要通过合理的稀释则对后续反应基本无不利影响，且丁酸能有效转化为目标产物，均有效降低了处理和发酵成本。 最后，本论文通过分析产溶剂梭菌Clostridiumsp.WK产物代谢通路及发酵特性的基础上，利用质粒pMTL83353实现2,3-丁二醇合成关键酶——乙酰乳酸脱羧酶在梭菌WK的过表达，进一步搭建2,3-丁二醇合成代谢通路，并最终成功实现了2,3-丁二醇在菌株WK的合成。实验结果表明，工程改造菌株WK::alsD-2可在发酵丁醇（7.61g/L）的基础上，进一步合成0.23g/L的2,3-丁二醇，同时也将副产物丙酮的产量降低了13.85%，这一过程不仅提升产品的工业价值，也有效减少了发酵中不必要的能量损耗。 总体而言，本论文建立了高效且具有成本效益的能源转化体系，相关成果不仅为解决海藻生物质转化丁醇生物的关键技术难题提供了思路，也进一步提升其他海洋生物质用于可再生生物能源开发的可能性。此外，通过过表达技术实现了2,3-丁二醇在产溶剂梭菌菌株WK的合成，不仅丰富了该菌株的产物种类，也更充分展现了其作为优势底盘菌株的巨大潜力，为最终实现大型藻类高值化利用过程提供有力平台。
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