摘要
甘蓝型油菜(BrassicanapusL.，AnAnCnCn，2n=4x=38)是我国种植面积最广的油料作物。甘蓝型油菜作为异源四倍体，其基因组的复杂性为我们了解这一重要作物的耐盐性带来了巨大挑战。在自然界由于人们不合理的施用化肥导致土壤多重胁迫的同时发生，土壤缺硼和盐渍化严重影响油菜植株的生长发育和籽粒产量。之前已经报道硼对铝胁迫、镉胁迫有缓解作用，但对于硼是否可以缓解盐胁迫的研究相对较少。本论文以甘蓝型油菜为研究对象，通过多元素的离子稳态、基因差异表达、代谢物指纹图谱以及木质部Na+卸载基因BnaA2.HKT1;1和氨基酸转运基因BnaA9.AAP1功能的鉴定，全面分析硼对盐胁迫的调控机制。主要研究结果如下: 1.通过硼酸梯度实验研究不同浓度的硼酸对盐胁迫下油菜幼苗的生长影响。油菜幼苗经过200mMNaCl以及0.25μM、25μM、50μM、200μM、500μM硼酸处理3天，分析各项生理指标得出一致的结果:在一定浓度范围内，随着硼酸浓度的增加，植株的盐毒害症状得到缓解，而50μM硼酸处理下的油菜幼苗的生物量最大。 2.硼可以缓解盐胁迫造成的叶片焦枯、失绿等症状。在盐胁迫下，高硼处理(+B+NaCl，50μM硼酸+200mMNaCl)的植株出现子叶黄化、生物量降低等轻微的盐胁迫表型;而缺硼处理(-B+NaCl，0.25μM硼酸+200mMNaCl)的植株子叶明显焦枯，根尖和叶片积累更多的O2-和H2O2，植株体内丙二醛含量显著升高。这些结果说明硼对盐胁迫下油菜的生长有重要影响，高硼可以明显减少盐胁迫引起的H2O2、O2-和MDA的积累，缓解氧化损伤。 3.硼介导了Na+从根向地上部的长途转运过程。在盐胁迫条件下，高硼处理显著降低油菜体内Na+浓度，维持较低的Na+/K+比。另外高硼使Na+从根部向地上部转运的转运系数显著降低，说明硼影响Na+由根向地上部的长途运输。 4.盐胁迫条件下进行高硼和缺硼处理后，在根部和地上部分别鉴定17，022和21，532个差异表达基因，接着对差异表达基因进行KEGG通路和GO富集分析，结果显示主要富集到氨基酸代谢和细胞壁修饰相关通路。硼通过调控编码离子转运体、细胞壁合成基因和氧化还原调节相关的基因提高油菜的耐盐能力。 5.通过LC-MS分析盐胁迫下，高硼和低硼处理对植物体内代谢物的变化规律，结果表明，在地上部和根部共鉴定310和341种差异代谢物，主要集中在脂类分子、有机酸及其衍生物、黄酮类化合物和有机杂环化合物等。KEGG代谢通路分析表明，差异代谢物显著富集于氨基酸的生物合成、糖代谢等代谢途径。硼可能通过调节油菜幼苗根部和地上部中的氨基酸与碳水化合物的生物合成和新陈代谢来降低盐毒害。 6.通过分组织测定Na+含量，计算Na+的转运系数，可知硼参与油菜盐胁迫下Na+的长途转运;另外对差异表达基因和代谢物进行KEGG富集分析得到离子转运和氨基酸代谢发生显著变化，因此我们猜测木质部Na+卸载基因HKT和氨基酸转运基因AAP可能参与调节植物的耐盐性。我们经过对BnaHKTs和BnaAAPs家族成员表达丰度和差异倍数的分析，将BnaA2.HKT1;1和BnaA9.AAP1作为响应盐胁迫的候选基因。我们分别创制了BnaA2.HKT1;1和BnaA9.AAP1基因的CRISPR/Cas9敲除突变体和35S超表达材料，发现BnaA2.HKT1;1和BnaA9.AAP1突变体株系对盐胁迫更敏感，而BnaA2.HKT1;1和BnaA9.AAP1超表达株系对盐胁迫的耐受性显著增加，其生物量和根系生长显著高于野生型。 综上所述，本论文发现硼通过调控Bnad2.HKT1;1和BnaA9.AAP1表达，影响木质部Na+卸载和氨基酸转运过程，从而提高油菜的耐盐能力。本研究为油菜耐盐性的遗传改良提供优异的基因资源，同时也为盐碱地油菜高产育种提供了有价值的信息和新的策略。
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