摘要
目的： 将分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）进行VEGF165、NT-3及Ang-1基因转染并接种于树枝状两亲性多肽（B-PA）自组装水凝胶进行共培养，观察细胞在水凝胶内、在VEGF165、NT-3、Ang-1基因诱导下向血管内皮细胞及神经细胞转分化。以期待构建合成的树枝状两亲性肽可作为脊髓组织工程支架。 方法： 1、从21天大鼠骨髓中分离、培养骨髓间充质干细胞(BMSCs），用倒置相差显微镜观察细胞形态，采用流式细胞术对骨髓间充质干细胞进行鉴定；同时将细胞催分化，使用油红O染色及茜红素S染色对细胞干性进行鉴定。 2、采用固相自动多肽合成仪(SPPS)上合成特定的B-PA，并运用高效液相色谱(HPLC）与质谱仪（MS)对其进行表征进行分析。配制不同质量分数的B-PA溶液，观察不同质量分数的B-PA溶液成型能力，并对凝胶进行晾干并用透射电镜显微（TEM)观察水凝胶内部结构； 3、将大鼠BMSCs进行VEGF165、NT-3及Ang-1基因转染并接种于b-PA自组装凝胶内部，采用Calcein-AM/PI（死活细胞检测试剂）对共培养的转染后的BMSCs染色，用荧光显微镜观察细胞存活情况。采用CCK-8（细胞增殖实验）测不同浓度的B-PA水凝胶中转转染后的BMSCs的细胞增殖和细胞毒性作用；采用Hochest33342染色检测水凝胶对转染后的BMSCs的粘附能力； 4、将转染Adv-Bic及AdvNT-3的BMSCs与B-PA水凝胶体外共培养7d后免疫荧光及qRT-PCR检测。 结果： 1、倒置显微镜下可见提取细胞呈骨髓间充质细胞表现；流式细胞术检测结果显示：培养细胞表面分子CD29、CD44呈阳性表达，将成脂和成骨诱导分化后的细胞分别行茜素红染色及油红O染色。镜下可以看到大量钙结节形成（A组）；发现细胞内出现脂滴（B组）。 2、合成b-PA的分子纯度极高（95.8507%），1wt%b-PA溶液形成的凝胶粘弹性极好，紧贴瓶壁； 3、水凝胶与细胞共培养后cck-8检测、活死细胞染色显示水凝胶毒力小，细胞增值可，细胞粘附实验证明水凝胶（B-PA）粘附效果好； 4、免疫荧光及qRT-PCR显示：细胞在凝胶内部可高表达VEGF165、NT-3及Ang-1，CD31+/34+、NSE及Nestin均明显增加： 结论： 树枝状两亲性肽（B-PA）形成的水凝胶具有诱导转染VEGF165、NT-3及Ang-1基因的BMSCs向神经元细胞及血管内皮细胞方向分化的能力。
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