摘要
产肠毒素大肠杆菌（EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC）是临床造成仔猪腹泻的主要病原菌之一，黏附作用在其致病过程发挥重要作用，并且可以促使细菌生成生物膜。临床上使用抗生素会导致细菌耐药和抗生素残留，因此寻找替代抗生素的药物成为关键。中药及其有效成分在抗细菌毒力因子方面有很好的效果，不造成细菌生长压力，通过调节毒力因子、群体感应和生物膜生成等降低细菌致病性，极大地降低了细菌耐药性发生概率。本研究以槲皮素为研究对象，选择对细菌生长不产生抑制作用的药物浓度，研究槲皮素对ETEC的转录组学、群体感应、生物膜和抗炎性损伤作用等方面进行了一系列探讨，阐明槲皮素抑制产肠毒素大肠杆菌的群体感应系统，及其抑制炎性损伤的机制。具体试验内容及结果如下所述： 首先，评价槲皮素对ETEC-O139的抑菌作用，结果表明槲皮素在0~40μg/mL的浓度范围没有抑制ETEC-O139生长，通过使用现代分子测序技术RNA-seq进行测序，结果表明ETEC-O139分别经过10μg/mL和20μg/mL槲皮素处理后，分别有12个和20个差异基因表达，将差异基因进行GeneOntology（GO）分析，发现槲皮素在细胞及细胞区域、细胞膜及膜区域和巨型分子复合物等部位发挥结合、催化活性和核酸结合转录因子活性的分子功能，引起ETEC-O139的细胞过程、代谢过程、对刺激反应、生物调节、生物过程调节、定植、移动和单有机体过程和多有机体过程等生物学过程变化。然后分析差异基因表达在通路发生的变化，通过KEGG公共通路数据库，分析发现细菌趋化、LPS合成、ABC转运体、群体感应和生物膜生成等通路发生变化。 通过结晶紫法测量生物膜生成，发现槲皮素可以显著抑制ETEC-O139生物膜生成。通过测量光量子数的方法进行检测，发现槲皮素可以显著抑制ETEC-O139的AI-2产生。通过RT-PCR检测槲皮素对生物膜和群体感应相关基因的表达影响，结果显示槲皮素可以显著抑制LuxS、Pfs、LsrK、LsrB、FliC、CsgA、CsgB、FimA和Rpos的表达。尽管槲皮素不能显著抑制ETEC-O139生长，但其可以抑制群体感应和生物膜生成。 根据上述试验结果，通过建立猪小肠上皮细胞的炎性损伤模型，进一步研究槲皮素的抗炎保护作用机制。通过检测ETEC-O139对IPEC-J2细胞的黏附，发现槲皮素可以显著抑制ETEC-O139的黏附。又通过测量乳酸脱氢酶，检测槲皮素对IPEC-J2细胞的保护作用，结果显示槲皮素可以显著降低ETEC-O139诱导的IPEC-J2细胞的乳酸脱氢酶的释放。通过ELISA和RT-PCR法分别检测了IPEC-J2细胞炎性细胞因子分泌，槲皮素可以显著抑制白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌以及基因表达，说明槲皮素具有抗炎作用。进一步研究结果显示槲皮素抑制TLR4、MyD88和NF-κB的mRNA表达，说明槲皮素抗炎作用是通过抑制TLR4信号通路和下游的NF-κB信号通路实现的。 综上所述，槲皮素影响了ETEC-O139的转录组，同时对其群体感应和生物膜生成通路研究发现槲皮素抑制了ETEC-O139群体感应及生物膜生成相关基因表达。此外，槲皮素降低了ETEC-139对IPEC-J2的黏附能力，减轻了ETEC-O139诱导IPEC-J2的产生炎性损伤，发挥其抗感染和消炎的作用，保护肠道细胞免受细菌感染的作用。在防治ETEC方面提供理论依据，同时在替代抗生素和降低细菌耐药方面提供新的思路，具有重要的借鉴意义。
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