摘要
【目的】 1.检测hsa_circ_0001944在白血病及健康人群中的表达水平。 2.研究hsa_circ_0001944在氢醌恶转细胞中的作用。 3.探讨氢醌诱导的恶性转化细胞中hsa_circ_0001944，PARP1（聚ADP核糖聚合酶1）与HuR（人蛋白R）的关系。 【方法】 1.白血病患者与对照组的选择 广东医科大学湛江附属医院收集30位白血病患者与30位对照组体检人员各5mL新鲜血液。样品收集后立即-80?C储存。按照白血病患者的年龄，性别，吸烟和饮酒史，筛选对照组成员进行配对。 2.细胞的选择 利用氢醌恶转细胞模型模拟白血病的发病过程。分别用氢醌及磷酸盐缓冲液处理TK6细胞20周后得到氢醌恶转细胞模型，并分别为其命名为HQ-TK6细胞与PBS-TK6细胞。 3.基因表达水平的检测 细胞与血液总RNA分别使用TRIzol试剂和HighPureRNAIsolationKit试剂盒进行提取，利用qRT-PCR技术检测CircRNA及有关信使RNA的表达水平。收集5×106个细胞之后使用裂解液裂解细胞提取总蛋白，利用BCA法检测提取的总蛋白浓度，WesternBlotting用于检测有关蛋白的表达水平。 4.hsa_circ_0001944敲低细胞株的构建 采用CRISPR/CAS9基因编辑方法，在课题组前期培养的HQ-TK6细胞基础上，再转染空载体或靶向敲低hsa_circ_0001944的慢病毒，使用嘌呤霉素筛选出转染细胞株，用qRT-PCR对其表达量进行敲除鉴定。 5.流式细胞术检测凋亡、周期及ROS含量 凋亡与周期分别采用AnnexinV-PE/7AAD试剂盒与PI对细胞进行预处理；ROS检测采用DHE探针进行孵育标记。制备样品，处理完成后立刻上机检测其凋亡、周期分布水平及细胞内部ROS含量。 6.生物信息学的分析 在生物信息学网站（http://rbpmap.technion.ac.il/;http://www.rnainter.org/;http://rbpdb.ccbr.utoronto.ca/;http://gepia2.cancer-pku.cn）预测hsa_circ_0001944的靶标RNA结合蛋白以及白血病内的PARP1的表达。 7.统计学分析 实验结果的各项指标通过SPSS软件进行统计学分析。计量资料采用mean±s进行表示，采用t检验及方差分析进行组间比较，检验水准α=0.05。 【结果】 1.CircRNA在白血病人群与HQ-TK6细胞中的表达情况： qRT-PCR检测结果显示，白血病患者体内hsa_circ_0001944的表达水平相对于对照组而言是上升，在HQ-TK6细胞中hsa_circ_0001944的表达相对于PBS-TK6细胞上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。 2.CircRNA敲低细胞株的构建： 利用HQ-TK6细胞以RNAi构建hsa_circ_0001944敲低细胞株，利用qRT-PCR检测其敲低效率，差异有明显的统计学意义（P＜0.05）。为其命名为shNC，sh1944-1，sh1944-2与sh1944-3。由于sh1944-3在培养时发现凋亡率大于其增长效率，导致无法扩增样品无法收集，故弃用。 3.hsa_circ_0001944的敲低导致细胞周期迟滞： 与shNC细胞相比，CCK-8实验中sh1944-1与sh1944-2在72h后其吸光度有下降，差异具有明显的统计学意义。利用流式细胞术检测hsa_circ_0001944敲低对周期的影响。相对于shNC组，sh1944-1呈现出G1/S期停滞现象，G1期细胞数量上升10.1%，S期细胞数量下降10.1%，差异有统计学意义（P＜0.05）。 4.hsa_circ_0001944的敲低诱导细胞凋亡： 流式细胞术显示，相对于shNC细胞，sh1944-1的凋亡率有显著上升，其差异有统计学意义（P＜0.05）。共聚焦成像证实，相对于shNC细胞，sh1944-1及sh1944-2的LC3A/B蛋白分布均有所差异，与细胞核有重叠，证实hsa_circ_0001944的敲低诱导细胞发生自噬从而引发凋亡。 5.WesternBlotting检测相关通路蛋白表达： 检测shNC，sh1944-1及sh1944-2细胞内凋亡、周期及DNA损伤相关蛋白的表达。与对照组相比，Bcl2，Bax，LC3A/B，Ki67，P-Rb，PARP1与H-Ras均呈下降趋势，γ-H2AX的表达量上升，HuR表达量不变。综合以上WB结果可推测，hsa_circ_0001944可参与凋亡通路、细胞周期以及DNA损伤修复通路的调节。 6.生物信息学预测hsa_circ_0001944的靶标RNA结合蛋白： 生物信息学分析不同数据库预测hsa_circ_0001944的靶标RNA结合蛋白，取交集后发现唯一的一个靶标RNA结合蛋白为HuR，提示两者间存在相互作用。 7.hsa_circ_0001944解离HuR与PARP1的结合： 生物信息学提示白血病患者中PARP1的表达与对照组相比要低，与hsa_circ_0001944敲低后PARP1的表达相符。共聚焦成像可看出，HuR、PARP1与hsa_circ_0001944都在胞质中互相重叠，提示有结合的可能。结合HuR的表达在hsa_circ_0001944敲低前后并无改变，我们推测，hsa_circ_0001944解离HuR与PARP1的结合并影响PARP1的表达。 【结论】 1.hsa_circ_0001944在白血病患者以及氢醌恶转TK6细胞中均表达上升。 2.在氢醌恶转TK6细胞中hsa_circ_0001944和PARP1通过自噬和细胞周期机制调节细胞生长。 3.hsa_circ_0001944解离HuR与PARP1的结合并影响PARP1的表达。
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