摘要
【目的】 “达拉菲尼和曲美替尼”联合靶向治疗是黑色素瘤患者（携带BRAF突变）的一线用药，但容易产生耐药性，机制不完全清楚。本项目的主要目的如下。 1.探索“达拉菲尼和曲美替尼”联合作用是否能诱导黑色素瘤细胞衰老及其衰老相关特征。 2.观察“达拉菲尼和曲美替尼”联合诱导的衰老黑色素瘤细胞上清液对药物作用的影响；初步筛选衰老上清液中可能促进药物抵抗的分泌因子。 【方法】 1.用不同浓度的达拉菲尼或曲美替尼作用黑色素瘤A375细胞（BRAFV600E），检测吸光度并分别计算两种药物的IC50（halfmaximalinhibitoryconcentration）。 2.参考IC50值设置不同浓度的达拉菲尼或曲美替尼，单独或联合处理BRAFV600E突变的黑色素瘤细胞（A375、M14、A875），7天后进行衰老相关的β-半乳糖苷酶（senescence-associatedbeta-galactosidasde，SA-β-Gal）染色，观察β-Gal染色阳性率。 3.用“达拉菲尼（0.375μmol/L）和曲美替尼（0.015μmol/L）”处理黑色素瘤细胞7天，免疫荧光染色观察LaminB1蛋白表达水平。 4.提取药物处理后的衰老黑色素瘤细胞总蛋白，采用WesternBlot检测药物效应通路、细胞周期通路（p53/p21、p16/pRb、CyclinD1）、DNA损伤标志物等蛋白的表达情况。 5.收集经“达拉菲尼和曲美替尼”联合处理后的应激细胞上清液和衰老黑色素瘤细胞上清液，同时收集常规培养的非衰老黑色素瘤细胞上清液作对照，将三种上清液分别加入细胞中，再加入溶剂或“达拉菲尼（0.375μmol/L）和曲美替尼（0.015μmol/L）”，观察三种上清液对细胞增殖的影响。 6.将非衰老细胞上清液、应激细胞上清液和衰老细胞上清液分别加入黑色素瘤细胞中，随后加入不同组合浓度的“达拉菲尼和曲美替尼”，培养4天后检测吸光度，计算IC50，观察衰老细胞上清液能否促进细胞抵抗药物作用。 7.用常规培养的A375细胞和药物诱导的衰老A375细胞进行mRNA转录组测序，通过分析测序数据筛选出衰老细胞高表达的SASP因子。 8.用Luminex液相芯片验证部分SASP因子的分泌水平，初步筛选出可能参与抵抗达拉菲尼和曲美替尼联合作用的SASP因子。 9.用不同浓度的Senolytic药物（槲皮素和ABT263）处理衰老A375细胞，通过SA-β-Gal染色或克隆形成实验，探索Senolytic药物可否特异性清除衰老A375细胞。 【结果】 1.通过IC50检测，达拉菲尼和曲美替尼对A375细胞的半抑制浓度分别为0.64μmol/L和0.02μmol/L。 2.SA-β-Gal染色显示，达拉菲尼和曲美替尼单独或联合作用，均可诱导含BRAFV600E突变的黑色素瘤细胞呈蓝染，且细胞形态稍有增大；两药联合作用时，β-Gal阳性细胞百分率随药物浓度而略升高，细胞增殖在较高浓度时被明显抑制。根据对增殖的抑制并结合β-Gal阳性百分率，选取0.375μmol/L达拉菲尼和0.015μmol/L曲美替尼作为后续实验的药物浓度。 3.免疫荧光实验发现，与NC组相比，达拉菲尼和曲美替尼单独或联合处理的黑色素瘤细胞中，LaminB1蛋白表达量显著降低。 4.WesternBlot结果表明，达拉菲尼和曲美替尼单独或联合作用，均未明显激活细胞衰老通路p53/p21，但激活了DNA损伤标志物γH2AX（除A875）。且调控细胞周期的CyclinD1、pRb蛋白表达显著下调。此外，p-Akt蛋白表达明显升高，而p-ERK1/2表达量大幅减少。 5.克隆形成实验证实，衰老黑色素瘤细胞上清液可拮抗“达拉菲尼和曲美替尼”对细胞增殖的联合抑制作用，而非衰老黑色素瘤细胞上清液则作用不明显。 6.将“达拉菲尼和曲美替尼”一同加入含不同上清液的细胞培养液中，发现药物在衰老细胞上清液中的IC50最大，而在非衰老黑色素瘤细胞上清液中的IC50最小，说明衰老细胞上清液中存在拮抗药物的分泌因子。 7.对“达拉菲尼和曲美替尼”联合诱导的衰老A375细胞、正常培养的A375细胞进行mRNA转录组测序，筛选出88个在衰老A375细胞中表达上调的SASP因子，用Luminex液相芯片检测了其中13个SASP因子的分泌水平，结果显示，IL-6、CCL2、FGF1、CXCL10和ALCAM因子的分泌水平在三种衰老黑色素瘤细胞中均明显升高。 8.用槲皮素和ABT263处理衰老黑色素瘤细胞，SA-β-Gal染色和克隆形成实验显示，两者均不能特异性清除衰老细胞。 【结论】 1.达拉菲尼和曲美替尼单独或联合作用，均可诱导BRAFV600E突变黑色素瘤细胞发生衰老，衰老细胞表现出增殖停滞、形态增大、β-Gal染色增强等衰老特征，衰老机制可能与CyclinD1、pRb及LaminB1蛋白表达下调有关。 2.“达拉菲尼和曲美替尼”联合处理后的衰老细胞上清夜，可拮抗“达拉菲尼和曲美替尼”对黑色素瘤细胞的联合抑制作用，机制可能与IL-6、CCL2等因子分泌水平的增加有关。 3.Senolytic药物槲皮素和ABT263不能特异性清除衰老黑色素瘤细胞。
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