摘要
【目的】 1.筛选酶解可口革囊星虫的最佳蛋白酶并优化其酶解工艺。 2.采用体内、外实验研究可口革囊星虫多肽的抗氧化活性。 3.制备可口革囊星虫抗氧化多肽咀嚼片。 【方法】 1.以DPPH自由基清除率和可溶性蛋白含量为指标，从菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、动物水解蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶中筛选酶解可口革囊星虫的最佳蛋白酶。 2.通过单因素实验和L9(34)正交试验对可口革囊星虫中性蛋白酶和风味蛋白酶酶解工艺进行优化。 3.通过膜分离系统将可口革囊星虫多肽分为＜10k和＞10k组分，以肌肽为阳性对照，检测可口革囊星虫多肽不同组分的DPPH自由基清除率、超氧阴离子清除率、羟自由基清除率和总抗氧化能力。 4.采取颈背部皮下注射D-半乳糖构建ICR小鼠亚急性衰老模型。将50只5-6周龄，体重为18-20g的小鼠随机分为对照组、模型组、中性蛋白酶酶解可口革囊星虫多肽组（400mg/Kg/day）、风味蛋白酶酶解可口革囊星虫多肽组（400mg/Kg/day）以及VC阳性对照组（200mg/Kg/day），每组10只，雌雄各半。皮下注射D-半乳糖造模的同时灌胃给药，每天一次，连续8周，每周称重记录小鼠体质量。8周后采用试剂盒测定小鼠血清、肝脏组织、脑组织的丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性、过氧化氢酶（CAT）活性和总抗氧化能力（T-AOC）。采用HE染色的方法观察小鼠肝组织、脑组织海马体区域的病理变化。 5.选用麦芽糊精为粘合剂，赤藓糖醇为甜味剂，柠檬酸为酸味剂，采用粉末直接压片法制备可口革囊星虫多肽咀嚼片。以咀嚼片的感官评分为指标，采用单因素实验和正交试验，确定可口革囊星虫多肽咀嚼片的最佳配比。 【结果】 1.以各蛋白酶酶解产物的DPPH自由基清除率为主要指标，综合考察酶解产物中的可溶性蛋白含量，最终选择DPPH自由基清除能力最强的中性蛋白酶和风味蛋白酶为可口革囊星虫酶解的最优蛋白酶。 2.L9(34)正交试验确定可口革囊星虫中性蛋白酶最优酶解的条件为：料液比为1∶3，加酶量为0.5%，温度为45℃，pH为6.5，酶解时间为4h，在此条件下DPPH自由基清除率为94.36%；风味蛋白酶最优酶解的条件为：料液比为1∶3，加酶量为0.5%，温度为40℃，pH为5.5，酶解时间为3h，在此条件下DPPH自由基清除率为95.63%。 3.中性蛋白酶酶解可口革囊星虫＜10k组分的多肽清除DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的IC50值分别为0.99mg/mL、4.17mg/mL、38.85mg/mL，每克中性蛋白酶酶解可口革囊星虫＜10k组分多肽的总抗氧化能力相当于0.0165mmol的水溶性维生素E（Trolox）；中性蛋白酶酶解可口革囊星虫＞10k组分的多肽清除DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的IC50值分别为1.76mg/mL、4.79mg/mL、49.30mg/mL，每克中性蛋白酶酶解可口革囊星虫＞10k组分多肽的总抗氧化能力相当于0.0116mmol的Trolox。 风味蛋白酶酶解可口革囊星虫＜10k组分的多肽清除DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的IC50值分别为2.78mg/mL、3.52mg/mL、13.10mg/mL，每克风味蛋白酶酶解可口革囊星虫＜10k组分多肽的总抗氧化能力相当于0.0104mmol的Trolox；风味蛋白酶酶解可口革囊星虫＞10k组分多肽清除DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的IC50值分别为3.94mg/mL、4.05mg/mL、24.83mg/mL，每克风味蛋白酶酶解可口革囊星虫＞10k组分多肽的总抗氧化能力相当于0.0071mmol的Trolox。 4.与对照组相比，模型组小鼠血清、肝脏组织和脑组织的丙二醛（MDA）含量升高（P＜0.01），超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性和总抗氧化能力（T-AOC）均降低（P＜0.01），表明亚急性衰老模型构建成功。与模型组相比，中性蛋白酶酶解多肽组（ZX组）和风味蛋白酶酶解多肽组（FW组）小鼠血清、肝脏组织和脑组织中MDA含量降低（P＜0.01）；与模型组相比，ZX组和FW组小鼠脑组织中SOD的活性提高（P＜0.01）；与模型组相比，ZX组小鼠血清中GSH-Px的活性提高（P＜0.05），ZX组和FW组小鼠肝脏组织和脑组织中GSH-Px的活性提高（P＜0.01）；与模型组相比，ZX组和FW组小鼠血清中CAT的活性提高（P＜0.05），ZX组和FW组小鼠肝脏和脑组织中CAT的活性提高（P＜0.01）；与模型组相比，ZX组小鼠血清的T-AOC提高（P＜0.01），ZX组和FW组小鼠肝组织和脑组织的T-AOC提高（P＜0.01）。小鼠肝脏和脑组织海马区病理学结果表明，可口革囊星虫多肽可以改善D-半乳糖造成的小鼠肝索排列紊乱和肝血窦扩张，降低肝细胞的脂肪变性，并维持衰老小鼠大脑海马区椎体神经元结构，保证其功能的完整性。 5.经正交试验可口革囊星虫多肽咀嚼片的最佳配比为：麦芽糊精与赤藓糖醇添加量比例为5∶4，多肽的添加量为2%，柠檬酸的添加量为5%。在该配比下，可口革囊星虫多肽咀嚼片边缘整齐，无破碎，色泽均匀呈乳白色，口感细腻，酸甜适口，有稍许海产品的鲜味，感官评分为88.26分。 【结论】 1.使用中性蛋白酶和风味蛋白酶酶解可口革囊星虫时可以得到最高DPPH自由基清除率和相对较高的可溶性蛋白。 2.中性蛋白酶酶解可口革囊星虫的最佳工艺为：料液比为1∶3，加酶量为0.5%，温度为45℃，pH为6.5，酶解时间为4h；风味蛋白酶酶解可口革囊星虫的最佳工艺为：料液比为1∶3，加酶量为0.5%，温度为40℃，pH为5.5，酶解时间为3h。 3.经中性蛋白酶和风味蛋白酶酶解后可口革囊星虫多肽具有较好的体内抗氧化活性，其中＜10k的多肽组分体外抗氧化活性明显好于＞10k的多肽组分。 4.可口革囊星虫多肽咀嚼片的最佳配比为：麦芽糊精与赤藓糖醇添加量比例为5∶4，多肽添加量为2%，柠檬酸添加量为5%。
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