摘要
铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是一种常见于土壤、水和空气的革兰氏阴性杆状细菌，同时也是一种机会致病微生物。铜绿假单胞菌对于医院的病人，尤其对ICU或者免疫受损的患者而言，是一个危险的潜在感染源。铜绿假单胞菌多耐药性菌株的出现是导致高死亡率的主要原因。因此，它已被世界卫生组织列为优先需要研究投资和新药开发的重要病原菌之一。 细菌必需基因(EssentialGenes)是指在丰富营养培养基条件下生长中不可或缺的管家基因。对铜绿假单胞菌必需基因进行深入研究，有助于筛选抵抗铜绿假单胞菌新的药物靶标。目前对于必需基因通量研究主要使用转座子测序技术。多项研究表明，在铜绿假单胞菌基因组中约有300多个必需基因。然而，目前对特定的必需基因进行反向遗传分析和抑制性分析的方法却很少。为了解决这个问题，我们开发了一个三步法策略，包括整合缺失质粒，引入温度敏感恢复质粒和反向筛选敲除质粒，以构建基于质粒的必需基因的温度敏感型突变株。以PA0006为例，我们发现三步法策略下构建的PA0006基因的温度敏感型突变株(Ts)在30℃条件下表现出野生型细胞形态，但在42℃条件下表现出长杆状，其长度可达到野生型细菌的3-5倍。通过序列比对，PA0006蛋白质序列与大肠杆菌中的甘油-甘露糖-双磷酸酶gmhB的相似性为32.5％，并且(E.coli)的过表达能部分回复PA0006(Ts)在42℃时所产生的基因功能缺陷。SDS-PAGE和免疫印迹（WB)分析表明，PA0006(Ts)在30℃时存在完整的O-抗原与核心寡糖结构，而在42℃时不存在。通过PA0006(Ts)的自发诱变分离到一个具有多重突变的抑制子（sup)。抑制子细胞可以抑制条件突变株在42℃出现的丝状表型，但核心寡糖结构仍然缺失。结合基因组重测序与转录组学分析，我们认为一些候选磷酸酶过表达可能在恢复PA0006(Ts)的致死表型中发挥作用。进一步研究发现，只有PA5110(果糖1，6-二磷酸酶，fbp)的过表达能够恢复PA0006(Ts)的致死表型。 综上所述，我们的结果表明PA0006在核心寡糖的生物合成中起重要作用。这种用于构建铜绿假单胞菌条件致死等位基因型的三步法策略也适用于其他必需基因的遗传分析以及抑制性分析。
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