摘要
棉铃虫Helicoverpaarmigera是世界范围内的农业害虫，嗅觉在棉铃虫的取食、交配和产卵等行为中起着重要的作用。棉铃虫的嗅觉系统包括外周感受系统和中枢神经系统。气味分子通过外周感受器进入血淋巴，与气味结合蛋白结合，转运至气味受体并相互作用，从而激活嗅觉受体神经元，产生膜电位，实现化学信号转变为电信号的过程。嗅觉受体神经元通过轴突将电信号传入中枢神经系统，昆虫经气味信息整合后做出相应的反应。转录因子在昆虫的嗅觉相关蛋白的表达和神经轴突靶向调控中起到重要的作用，因而对嗅觉相关转录因子的研究有助于阐明昆虫的嗅觉机制。本文以棉铃虫为研究对象，分析头部转录组数据，挖掘与嗅觉调控相关的转录因子，获得一个POU家族转录因子abnormalChemosensoryjump6（acj6），解析了该转录因子的生物信息学和表达模式，并通过CRISPR/Cas9技术介导acj6在棉铃虫体内的敲除来探究其在棉铃虫体内行使的生物学功能，具体研究结果如下： （1）筛选与棉铃虫嗅觉相关的转录因子：采用RNA-seq技术对棉铃虫头部转录组数据进行解析，通过与转录因子数据库进行比对，在转录组数据中共获得54个家族中的313个转录因子，鉴定出18个在棉铃虫中可能涉及嗅觉神经发育和嗅觉相关蛋白表达的转录因子，挑选出一个转录因子acj6做后续研究。 （2）Haacj6的生物学分析：经序列克隆验证发现Haacj6包含5个外显子区域并且存在两个可变剪接体。Haacj6transcriptvariantA序列全长为1071个碱基，编码357个氨基酸；Haacj6transcriptvariantB序列全长为1048个碱基，编码349个氨基酸。Haacj6isoformA和Haacj6isoformB均为亲水性不稳定蛋白，属于HomeodomainPOU家族，包含三个结构域POUIVbox，POUspecificdomain和POUhomeodomain。根据氨基酸同源性分析和系统发育树构建结果可得，acj6在鳞翅目昆虫中的同源性很高，达到95%以上。通过半定量PCR和荧光定量PCR技术对Haacj6的表达谱进行解析，表明Haacj6在棉铃虫幼虫、蛹和成虫中均有表达；在成虫中，Haacj6在触角和下唇须表达量最高，在头和胸部表达量次之。 （3）CRISPR介导Haacj6基因敲除：在Haacj6基因外显子1上设计两个相距29bp的sgRNA位点，使用显微注射法对棉铃虫的卵注射sgRNA与Cas9蛋白。通过对比单靶点敲除和双靶点敲除的敲除率，发现双靶点敲除的敲除率较单靶点敲除高20%-40%。双靶点敲除获得5头纯合体雄虫，对这5头突变体进行触角和触角叶形态的观察，发现触角发生程度不同的畸形，鞭节顶端呈烧焦状和膨大状；突变体触角叶内嗅觉纤维球的形态与野生型相比呈弥散状，并且扩大型纤维球复合体区域内背中间神经元纤维球的体积与野生型相比显著减少。 （4）Haacj6突变体转录组差异分析：通过RNA-seq技术，获取Haacj6突变体头部的转录组数据，与野生型数据进行比对，筛选出敲除Haacj6后有显著差异的基因。通过序列表达量差异分析，经CRISPR敲除后共有41个基因上调，105个基因下调，差异基因共发掘出13个与神经发育相关的基因和5个与化学信息感受相关的基因。 以上结果表明，Haacj6对于棉铃虫的触角感受器和触角叶内嗅觉纤维球的形成以及嗅觉相关蛋白的表达起到不可或缺的作用，为深入研究棉铃虫嗅觉的调控机制奠定基础。
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