摘要
蜜蜂是社会性昆虫，可以授粉、产蜜、药用，具有重要的生态、经济及应用价值。乳酸菌作为蜜蜂肠道内重要的益生菌，在抵御病原菌、调节新陈代谢、抵抗极端环境等方面发挥着重要的作用。本研究对蜜蜂肠道内乳酸菌进行分离纯化，将分离到的398个菌株进行分类和统计，分析蜜蜂肠道内乳酸菌的多样性。通过16SrRNA和pheS基因序列分析，对乳酸菌的多样性进行了分析;发现5个乳酸菌潜在新种，采用细菌多相鉴定手段（表型，遗传和系统发育等）确定了它们的分类学地位。 蜜蜂采自9个地区的养蜂场，将其肠道中分离到的乳酸菌进行分类，398株乳酸菌可分为30个种及5个潜在新种，分布于12个属:Lactobacillus（162株，41％）、Limosilactobacillus(2株，＜1％)、Apilactobacillus(139株，35％)、Secundilactobacillus(11株，3％)、Lacticaseibacillus(1株，＜1％)、Lactiplantibacillus(2株，＜1％)、Companilactobacillus(2株，1％)、Lactococcus（27株，7％）、Weissella（5株，1％）、Leuconostoc（12株，3％）、Enterococcus（16株，4％）和Bifidobacterium（19株，5％）。按地区进行分类统计后，陕西、湖北地区的乳酸菌菌种多样性最为丰富。 研究发现:Lactococcuslactissubsp.lactis和Lactococcuslactissubsp.hordniae属于同一个种，即Lactococcuslactis;而Lactococcuslactissubsp.cremoris和Lactococcuslactissubsp.tructae不属于Lactococcuslactis，它们代表着乳球菌属内的一个新种。Lactococcuslactissubsp.cremoris和Lactococcuslactissubsp.tructae与系统发育相关种（Lactococcuslactissubsp.lactis、Lactococcuslactissubsp.hordniae、Lactococcustaiwanensis、Lactococcuskimchii、Lactococcusallomyrinae、Lactococcusprotaetiae、Lactococcushircilactis、Lactococcusfujiensis和Lactococcusnasutitermitis）的模式菌株之间的16SrRNA、rpoB、recA、pheS和串联rpoB、recA和pheS基因序列相似性分别为93.5～99.4％、83.3～97.6％、80.6～92.4％、79.7～92.7％、83.5～94.3％;ANI值和dDDH值为72.4～86.9％和21.4～32.5％。Lactococcuslactissubsp.cremoris、Lactococcuslactissubsp.tructae更名为Lactococcuscremorissubsp.cremoriscomb.nov.、Lactococcuscremorissubsp.tructaecomb.nov.。 Apilactobacilluskosoi和Apilactobacillusmicheneri的模式菌株之间16SrRNA、pheS及rpoA基因序列相似性为100％、99.6％和100％;ANI相似性为97.3％，dDDH相似性为76.6％。ANI和dDDH值表明Apilactobacilluskosoi和Apilactobacillusmicheneri属于同一个种。 菌株F306-1T和F551-2T与系统发育相关种（Laclobacillushelsingborgensis、Lactobacillusmelliventris、Lactobacilluskimbladii、Lactobacilluskullabergensis、Lactobacillusapis、Lactobacilluspanisapium、Lactobacillusbombicola和Lactobacillusacetotolerans）的模式菌株之间的16SrRNA、pheS和rpoA基因序列相似性分别为93.0～98.9％、75.6～96.5％和86.2～100％，ANI值为74.9～94.4％，dDDH值为19.1～56.7％，AAI值为74.4～95.8％;菌株F306-1T和F551-2T之间的ANI值为92.1％，dDDH值为45.8％，AAI值为93.7％。ANI值和dDDH值表明F306-1T和F551-2T为Lactobacillus属内的2个新种，分别命名为Lactobacillushuangpiensissp.nov.、Lactobacilluslaiwuensissp.nov.。 菌株F502-1T和F575-4T与系统发育相关种（Apilactobacillusnanyangensis、Apilactobacilluskunkeei、Apilactobacillusapinorum、Apilactobacillusbombintestini、Apilactobacillusmicheneri、Apilactobacillustimberlakei、Apilactobacillusquenuiae和Apilactobacillusozensis）的模式菌株之间的16SrRNA、pheS和rpoA基因序列相似性分别为95.0～99.9％、81.6～92.5％和85.9～99.0％，ANI值为71.7～91.3％，dDDH值为17.2～43.5％，AAI值为66.1～94.6％;菌株F502-1T和F575-4T之间的ANI值为72.1％，dDDH值为17.5％，AAI值为66.1％。ANI值和dDDH值表明F502-1T和F575-4T为Apilactobacillus属内的2个新种，分别命名为Apilactobacilluszhangqiuensissp.nov.、Apilactobacillusxinyiensissp.nov.。 菌株S053-2T与系统发育相关种（Bifidobacteriumasteroides、Bifidobacteriumindicum、Bifidobacteriumapousia、Bifidobacteriumcholadohabitans、Bifidobacteriumcoryneforme、Bifidobacteriumpolysaccharolyticum、Bifidobacteriumactinocoloniiforme、Bifidobacteriumxylocopae）的模式菌株之间的16SrRNA、pheS、clpC和thrS基因序列相似性分别为95.5～99.7％、80.7～96.6％、82.8～95.0％和80.1～98.6％，ANI值、dDDH值和AAI值分别分别为74.5～93.8％、21.2～52.4％，68.6～94.9％。ANI值和dDDH值表明S053-2T为Bifidobacterium属内的1个新种，命名为Bifidobacteriummizhiensesp.nov.。 本研究通过对蜜蜂肠道内乳酸菌菌株的分离鉴定，扩大了对蜜蜂肠道中可培养乳酸菌种群多样性的认识，除了常见的Lactobacillus、Apilactobacillus和Bifidobacterium乳酸菌属外，还发现了Limosilactobacillus、Secundilaciobacillus、Lacticaseibacillus、Lactiplantibacillus、Companilactobacillus、Lactococcus、Weissella、Leuconostoc和Enterococcus等属内的乳酸菌。5个乳酸菌新种的发现，分别扩大了Lactobacillus、Apilactobacillus和Bifidobacterium的分类系统。此外，Lactococcuslactissubsp.cremoris与Lactococcuslactissubsp.tructae的重新分类使Lactococcuslactis和Lactococcus的分类更为合理，Apilactobacilluskosoi的重新分类使Apilactobacillus的分类更为合理。
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