摘要
溃疡性结肠炎(Ulcerativecolitis，UC)是一种特发性炎症性肠病，由于其经久不愈且易复发，已成为世界公共卫生面临的巨大挑战。硒(Selenium，Se)是机体必须的微量营养素，主要通过结合到硒蛋白中发挥一系列生物学功能。尽管UC的发病机制受多因素调控，膳食Se或硒蛋白缺乏会通过影响涉及氧化应激和炎症的多条信号通路加剧疾病进程。巨噬细胞在硒蛋白介导的胃肠道炎症和激活宿主免疫反应中发挥重要作用，巨噬细胞外诱捕网(Macrophageextracellulartraps，METs)的释放已经成为参与机体疾病发展和恶化的重要效应机制。尽管目前关于硒蛋白O(SelenoproteinO，SelO)的报道较少，SelO已被确认具有重要的抗氧化活性。关于SelO以及METs释放在UC疾病中发挥的作用尚未见报道。本研究以8-10周龄野生型和SelO敲除型C57BL/6雄性小鼠为研究对象，通过给小鼠饮用7天2.5％葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液复制了UC模型，利用免疫共沉淀(CO-IP)联合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测、生信分析、蛋白免疫印迹(WB)、荧光共定位、蛋白对接模拟等方法，筛选并验证出与SelO相互作用的蛋白质;通过疾病活动指数(DAI)记录、苏木精&伊红染色、组织病理学分析、髓过氧化物酶(MPO)活性检测等方法，观察了小鼠结肠组织病理学变化，探讨了SelO敲除型小鼠对UC的易感性:应用免疫荧光染色、抗氧化功能检测、阿利新蓝-过典酸雪夫氏(AB/PAS)染色、实时荧光定量PCR、WB等试验技术手段，检测了小鼠结肠组织氧化应激水平，细胞焦亡、巨噬细胞募集、METs释放、炎性细胞因子分泌相关调控因子表达的变化以及肠黏膜屏障损伤情况。此外，在体外复制了小鼠结肠黏膜上皮细胞SelO沉默及蛋白酪氨酸激酶(Januskinase1，JAK1)抑制剂Upadacitinib或氧化应激抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)共处理模型，并构建了与小鼠巨噬细胞RAW264.7共培养体系，探究了SelO沉默对小鼠结肠黏膜上皮细胞的影响，以及SelO介导小鼠结肠黏膜上皮细胞对巨噬细胞的调控。本试验旨在探究SelO与小鼠UC疾病发生的关系和相关调控机制以及METs释放是否参与UC疾病进程的推动。试验结果如下: (1)SelO敲除对野生型小鼠体重和结肠长度变化没有显著影响。DSS诱导的UC模型中，SelO敲除降低小鼠存活率，显著降低小鼠体重、缩短结肠长度，导致DAI评分显著上升。此外，SelO敲除导致小鼠结肠组织杯状细胞部分丢失，组织内少量炎性细胞浸润。DSS诱导UC模型中，野生型小鼠结肠黏膜缺损，腺体结构紊乱，杯状细胞大量丢失同时伴有大量炎性细胞浸润;SelO敲除型小鼠结肠损伤更为严重，几乎不见完整黏膜结构，上皮大量剥落，炎性细胞浸润层次更深，组织病理学评分、MPO活性均显著高于野生型小鼠。上述结果表明，SelO敲除增加小鼠对UC易感性，并且会加剧UC小鼠结肠组织损伤。 (2)CO-IP联合LC-MS/MS分析发现JAK1是SelO潜在相互作用蛋白，经WB、荧光共定位和蛋白对接模拟确认两蛋白存在相互作用关系,在细胞膜表面和细胞质中均可形成稳定相互作用复合物。与野生型UC小鼠相比，SelO敲除型UC小鼠结肠组织中JAK1、STAT3表达水平显著升高，同时磷酸化水平显著提高。体外小鼠结肠黏膜上皮细胞中，SelO的低表达也显著激活JAK1/STAT3通路，而抑制JAK1酶活可以显著阻碍该通路的激活。上述结果表明，SelO敲除靶向激活JAK1/STAT3级联信号诱发小鼠结肠炎。 (3)SelO敲除显著抑制过CAT、SOD和GPx酶活，显著降低GSH含量，增加MDA含量，使结肠组织的总抗氧化能力(T-AOC)降低。DSS诱导的UC模型中，SelO敲除加剧了结肠组织内氧化还原稳态失衡。体外小鼠结肠黏膜上皮细胞中，SelO的低表达显著抑制CAT、SODs、GPxs基因的转录，刺激ROS的生成，而抑制JAK1酶活可以显著缓解SelO敲低诱导的细胞的氧化应激。上述结果表明，SelO敲除通过靶向调控JAK1/STAT3信号转导刺激UC小鼠结肠组织内氧化应激水平升高。 (4)SelO敲除显著提高结肠组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18细胞焦亡相关调控因子的基因转录和蛋白表达。DSS诱导的UC模型中，SelO敲除也显著刺激了结肠组织内NLRP3炎性小体的组装、GSDMD蛋白的切割和IL-1β、IL-18细胞因子的成熟。体外小鼠结肠黏膜上皮细胞试验中，SelO的低表达也得到与上述相似的结果，而抑制JAK1可以有效阻碍细胞焦亡水平的激活。上述结果表明，SelO敲除促进小鼠结肠细胞焦亡，释放炎性细胞因子，加剧UC小鼠结肠炎性损伤，并且JAK1/STAT3信号参与SelO对结肠细胞焦亡的调控。 (5)SelO敲除显著刺激小鼠结肠组织中CCL2、CCL7、CX3CL1、CCL3和CCL5巨噬细胞相关趋化因子的基因转录，但对CCL20基因的表达无显著影响。DSS诱导的UC模型中，SelO敲除型小鼠结肠组织内巨噬细胞募集趋化因子的表达更显著上升。体外小鼠结肠黏膜上皮细胞中，除CCL3外。SelO的低表达显著刺激了其他趋化因子基因的转录，JAK1抑制剂的共处理则显著抑制了趋化因子基因表达的上调。上述结果表明，SelO敲除靶向调控JAK1/STAT3轴诱导巨噬细胞向UC小鼠结肠损伤部位的募集。 (6)SelO敲除显著提高了小鼠结肠组织中METs释放调控因子NOX2、PAD2和PAD4，METs形成标志物H3(citH3)、NE和MPO以及促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-12的表达，显著抑制了抗炎细胞因子IL-10的表达。DSS诱导的UC模型中，SelO的缺失进一步刺激了METs的释放和促炎细胞因子的分泌。细胞共培养体系中，SelO敲低小鼠结肠黏膜上皮细胞显著刺激了巨噬细胞METs的释放和促炎细胞因子的分泌，而JAK1抑制剂或NAC的共处理可以有效缓解这种刺激作用。上述结果表明，SelO敲除靶向JAK1/STAT3轴调控细胞氧化应激进而介导结肠黏膜上皮细胞对巨噬细胞的刺激作用，诱导巨噬细胞释放METs及分泌炎性细胞因子，进一步放大了结肠组织内的炎性信号，造成UC小鼠结肠组织更严重的炎性损伤。 (7)SelO敲除显著抑制了小鼠结肠组织中Mucin2、ZO-1、Occludin和Claudin1的表达。DSS诱导的UC模型中，SelO缺失促进了黏蛋白和紧密连接蛋白的丢失。AB/PAS染色结果进一步确认SelO敲除型UC小鼠结肠黏膜表面黏液消失，杯状细胞严重耗竭，组织内黏蛋白分泌显著减少。体外小鼠结肠黏膜上皮细胞中，SelO的低表达显著抑制了黏蛋白和紧密连接蛋白的合成，而抑制JAK1酶活可以显著恢复它们的表达。上述结果表明，SelO敲除靶向JAK1/STAT3通路抑制结肠细胞黏蛋白的分泌，破坏细胞间的紧密连接，造成UC小鼠结肠组织黏膜屏障的严重缺陷。 综上所述，SelO缺失靶向激活JAK1/STAT3信号转导，提高结肠组织内氧化应激水平，促进结肠细胞焦亡，同时诱导巨噬细胞向组织损伤部位募集，刺激巨噬细胞释放METs、分泌炎性细胞因子，放大炎性信号，破坏结肠黏膜屏障，加剧UC小鼠结肠组织炎性损伤。本研究丰富了SelO的生理病理学功能，为寻找UC新的治疗策略和潜在靶点提供了重要理论依据，对保障人类健康具有重要意义。
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