摘要
印楝素是一种高效、低毒、易降解和低残留的生物源农药，对鳞翅目昆虫棉铃虫具有良好的防治效果，其作用机制是通过抑制幼虫取食，使之产生拒食效应，进而导致昆虫死亡。印楝素抑制糖原的合成，海藻糖不仅是昆虫体内的糖原而且是昆虫的“血糖”，而海藻糖酶（Trehalase，Treh）是目前已知的唯一能够水解海藻糖为葡萄糖的酶。海藻糖酶在昆虫生长发育、能量供应、几丁质生物合成和非生物胁迫等方面发挥着重要作用。印楝素是否通过调控海藻糖酶影响昆虫蜕皮变态并不清楚。在完全变态昆虫中，幼虫的蜕皮变态由蜕皮激素（20-hydroxyecdysone，20E）直接控制，该过程需要消耗大量能量。研究显示可溶型海藻糖酶（solubleTrehalase，Treh1）参与蜕皮变态过程，且Treh1转录表达和酶活性受到20E上调，但其中的分子机制研究并不深入。本研究以棉铃虫（Helicoverpaarmigera）为研究材料，研究了印楝素抑制HaTreh1活性最终导致幼虫变态失败的分子机制。本研究主要结果如下： 1、印楝素抑制棉铃虫幼虫蜕皮变态和Treh活性 饲喂1μg/mL印楝素后，5龄棉铃虫幼虫发育延迟、蜕皮异常、幼虫体重减轻且死亡率升高，最终死亡率达到93.33%，显著高于对照组的5.56%。分别饲喂1μg/mL和5μg/mL印楝素后，6龄棉铃虫幼虫发育延迟、无法正常变态化蛹、幼虫体重均显著降低且死亡率显著升高。幼虫对印楝素的反应具有剂量依赖效应。qRT-PCR结果显示，HaTPS1、HaTreh1和HaTreh2基因转录水平均显著降低，但HaTreh1基因表达量下降趋势更为明显。酶活测定结果显示，饲喂印楝素后，幼虫中肠中HaTreh1和HaTreh2酶活均显著降低，HaTreh1酶活降低更为显著。海藻糖含量测定结果显示，与对照组相比，饲喂1μg/mL和5μg/mL印楝素后幼虫中肠中海藻糖含量均显著降低，且具有剂量依赖效应。葡萄糖含量测定结果显示，与对照组相比，饲喂1μg/mL和5μg/mL印楝素幼虫中肠中葡萄糖含量均显著降低。 2、20E通过核受体途径上调HaTreh1的转录表达 组织发育表达模式分析结果显示，在表皮中，HaTreh1转录和酶活在蜕皮和变态期达到峰值；在中肠中，HaTreh1转录和酶活也在变态期达到峰值。20E处理上调HaTreh1的转录，敲低HaEcR-B1和HaUSP1转录表达导致20E无法上调HaTreh1转录表达。 3、降低HaTreh1转录表达导致幼虫体重下降和死亡率升高 在5龄幼虫中，注射dsHaTreh1成功敲低HaTreh1转录表达后，幼虫体重显著降低；在注射dsHaTreh1的24和48h后的死亡率分别为5.50%和24.40%，显著高于注射dsGFP对照组的1.10%和6.00%。在6龄幼虫中，注射dsHaTreh1后24到144h，幼虫体重均低于注射dsGFP对照组，实验组最终死亡率达到93.10%，显著高于对照组的7.60%。 4、20E增强HaTreh1和HaATPs-α直接结合控制ATP的产量 亚细胞定位结果显示，HaTreh1定位于线粒体。酵母双杂交、免疫共沉淀和GST下拉实验证明20E增强HaTreh1和HaATPs-α的直接结合。在6龄幼虫中敲低HaTreh1、HaATPs-α或同时敲低HaTreh1和HaATPs-α转录水平后，20E无法增加ATP的产量。 5、印楝素抑制20E信号通路下游基因转录表达并降低ATP产量 饲喂1μg/mL和5μg/mL印楝素后，6龄棉铃虫幼虫中肠中20E信号通路基因HaEcR-B1、HaUSP1和HaHR3基因转录水平均显著降低。与此同时，HaATPs-α的转录水平也显著降低。ATP含量测定结果显示，饲喂印楝素降低虫体ATP的产量。 综上所述，本研究揭示了饲喂印楝素抑制海藻糖酶的活性，导致20E无法增强HaTreh1和HaATPs-α互作而控制ATP产量，并且抑制20E信号转导，最终导致幼虫蜕皮变态失败的分子机理。
NETL