摘要
代谢型谷氨酸受体(Metabotropicglutamatereceptors，mGlu)属于C类G蛋白偶联受体(Gprotein.coupledreceptors，GPCR)，主要分布于中枢神经系统中，是重要的兴奋性神经递质受体。mGlu通过感知神经突触间隙或神经细胞周围环境中的兴奋性神经递质一一谷氨酸进行信号转导，进而调节神经递质的释放、神经元的生长等生理过程。研究发现，mGlu与学习、记忆、情绪调控等生理功能相关，是帕金森氏综合征、抑郁症、焦虑症、精神分裂症等精神类疾病潜在的药物靶点。 根据氨基酸序列同源性与下游信号的差异，mGlu可进一步分为三个亚家族。其中，GroupⅠ(mGlul和mGlu5)通过与Gq蛋白偶联进行信号转导，GroupⅡ(mGlu2和mGlu3)及GroupⅢ(mGlu4和mGlu6-8)通过与Gi蛋白偶联进行信号转导。与其他类型的GPCR相比，mGlu等C类GPCR除了具有经典的七次跨膜螺旋(Transmembranedomain，TMD)的结构特征以外，还具有庞大的胞外结构域(Extracellulardomain，ECD)，并且需要形成强制性的同源或异源二聚体才能正常行使功能。然而，由于相关结构信息的匮乏，长期以来mGlu如何与G蛋白等下游效应蛋白结合，以及mGlu二聚体中的两个单体如何协调并完成信号转导一直不清楚。 为此，本课题针对GroupⅡ及GroupⅢ的受体mGlu2和mGlu4进行信号转导和调控机制研究。我们分别对mGlu2-Gi和mGlu4-Gi复合物的组装方法、组装条件和纯化条件等进行了细致的筛选与优化，最终获得了稳定的复合物蛋白样品。随后，我们利用冷冻电镜技术成功解析了mGlu2-Gil和mGlu4-Gi3的三维结构。对上述两个复合物进行结构分析，发现mGlu2和mGlu4具有相似的信号转导模式，即mGlu二聚体通过其中的一个单体与一个Gi蛋白结合进行信号转导。与其他类型的GPCR相比，mGlu2和mGlu4具有独特的G蛋白结合模式:Gi蛋白的Q5螺旋结合在受体胞内侧的一个浅槽内，该结合位点由受体的第三和第四跨膜螺旋(TM3和TM4)以及三个胞内环(IntraceilularLoop)构成。此外，我们首次发现mGlu在信号转导过程中其跨膜结构域形成非对称二聚体。当mGlu2或mGlu4与Gi蛋白结合时，未结合G。蛋白的亚基(mGlufree)的TM1、TM6和TM7与结合Gi蛋白的亚基(mGluG)的TM5和TM6形成非对称的二聚体作用界面。我们进一步开展功能研究，结果显示将该作用界面的氨基酸突变后，受体激活下游信号通路的能力显著下降，证实了该非对称二聚体界面对于mGlu2和mGlu4的激活至关重要。同时，结构还阐明了mGlu2与其正向别构调节剂(Positiveallostericmodulator，PAM)的结合模式，以及PAM对受体功能的调控机制。上述研究结果与本课题组解析的处于非激活态和激活中间态的mGlu2结构，完整地阐释了mGlu2激活过程中的精细构象变化。 越来越多的研究表明，mGlu除了自身会形成同源二聚体以外，不同亚型的mGlu间也会形成异源二聚体。其中，mGlu2-mGlu7异源二聚体存在于海马体中，该异源二聚体与mGlu2、mGlu7同源二聚体相比具有显著不同的药理学特性(EC50和Em积)，这表明mGlu家族具有复杂且多样的功能调控模式。为此，我们针对mGlu2-mGlu7异源二聚体开展了结构和功能研究，以期揭示mGlu异源二聚体的组装机制和功能调控机理。我们在mGlu2和mGlu7的C末端分别连接FK506结合蛋白(FK506bindingprotein，FKBP)和雷帕霉素结合片段(rapamycinbindingfragment，FRB)，促进异源二聚体的形成;并先后通过两步不同的亲和层析纯化去除mGlu2和mGlu7同源二聚体，获得高纯度的异源二聚体蛋白样品;随后，利用冷冻电镜技术成功解析处于非激活态的mGlu2-mGlu7异源二聚体结构。通过结构比对发现，mGlu2-mGlu7异源二聚体的TMD间的二聚化方式与mGlu7同源二聚体类似，但明显区别于mGlu2同源二聚体。通过细胞信号转导实验，我们证实mGlu7亚基在mGlu2-mGlu7异源二聚体的信号转导中发挥主导作用。这项研究成果首次为理解mGlu的异源二聚化模式提供结构模型。 综上，在第一项研究中，我们解析了mGlu2、mGlu4分别与Gi蛋白的复合物结构，并结合突变体细胞信号转导实验，首次阐明mGlu信号转导过程的精细构象变化。在第二项研究中，我们解析了处于非激活状态的mGlu2-mGlu7异源二聚体的结构，并开展了功能研究，首次为mGlu异源二聚体研究提供了分子模型，揭示了mGlu异源二聚体复杂的功能调控与信号转导模式。上述研究成果为深入认识该类受体在中枢神经系统中的功能调控机理提供了直接的科学依据，对全面认识C类GPCR的信号转导机制具有重要意义。
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