摘要
目的： 当前有害结局路径（Adverseoutcomepathway，AOP）模型的构建和应用主要集中于生态环境毒性领域，与人类健康相关的AOP构建方法尤其是定量分析方法仍在探索之中。本研究利用高通量组学技术和计算模型，以关键毒性通路的扰动为核心事件，构建以芳香烃受体（Arylhydrocarbonreceptor，AHR）激活为分子起始事件（Molecularinitiatingevent，MIE）、肺损伤为不良结局的AOP框架，并对该模型进行评估与定量研究，为AOP框架应用于外源化学物的毒性预测和安全评价提供新的线索和研究手段。 方法： 基于课题组前期研究提出的芳香烃受体激活导致肺损伤的5条关键毒性通路，构建以毒性通路为关键分子事件的AOP网络。根据OECD的证据权重指南，评估AOP网络证据链条。利用Toxcast，Pubchem和比较毒理基因组数据库（Comparativetoxicogenomicsdatabase，CTD）等高通量数据结合机器学习模型对AOP网络进行多化学物的机制验证。 利用分子对接和表面等离子体共振实验（Surfaceplasmonresonance，SPR）研究苯并（a）芘（Benzo（a）pyrene，BaP）与AHR受体蛋白的结合能力。利用16HBE-CYP1A1细胞暴露多剂量苯并（a）芘的转录组学数据集研究毒性通路扰动的剂量-效应关系，具体包括：利用基因富集分析（Genesetenrichmentanalysis，GSEA）软件和BMDExpress软件进行通路富集和剂量分析，并根据各通路的基准剂量判断相关效应的体外离体点（Pointofdeparture，PoD）；从毒性通路中选择特定的模式基因，对5条毒性通路进行应答顺序验证。此外，利用细胞学实验进一步定量分析AOP网络中的关键细胞关键事件，包括活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）的产生、IL-6的释放、8-OHdG释放和胶原蛋白Ⅰ的生成。最后，结合多剂量转录组数据和细胞学实验数据构建定量AOP网络，并利用非线性拟合方程探索相邻关键事件的效应-效应模型。 结果： 根据前期数据，我们将构建的7条线性AOP集成为AOP网络，该AOP网络以AHR激活为分子起始事件，包含5个基于毒性通路的分子关键事件、9个细胞组织层次的关键事件和3个肺损伤有害结局。根据证据权重标准对AOP进行分析，在22条关键事件关系中，生物学合理性评价较高的关键事件关系有18条，生物学合理性评价适中的关键事件关系有4条。利用32个体外高通量数据构建了7个机器学习模型，并利用这些模型和CTD数据库的表型与疾病分析数据对AOP网络中6个关键事件和3个不良结局进行验证分析，其结果提示在2629个AHR活性化学物中，最终有6、8、2、28、30、20和72个化学物分别可以激活7条线性AOP。 分子对接结果显示苯并（a）芘和AHR蛋白的结合分数为–4.38kcal/mol，并且SPR结果证明苯并（a）芘与AHR受体的体外结合作用具有剂量依赖性。此外，AHR的核质分离、实时荧光定量和蛋白免疫印迹实验结果提示苯并（a）芘可以激活AHR入核发挥转录作用并在细胞内降解。GSEA分析证明苯并（a）芘暴露的转录组数据可以显著富集在5条毒性通路中。毒性通路的时间效应分析结果提示5条毒性通路的应答顺序依次为外源代谢AHR通路、氧化应激NRF2通路、炎症反应IL-6通路、纤维化HF通路和p53通路。进一步的剂量效应分析显示AHR基因具有最低的基准剂量，提示AHR通路是应答最敏感的毒性通路，其PoD为0.0044μM，该分析结果与时间分析结果相一致。细胞学实验结果显示，苯并（a）芘暴露会使ROS释放、8-OHdG水平、IL-6释放和胶原蛋白积累在内的细胞关键事件呈现剂量依赖性的增加。最后，我们探索了分子起始事件与毒性通路以及毒性通路与细胞关键事件之间的效应-效应拟合关系，为AHR激活相关化学物的毒性预测提供定量信息。 结论： 本研究首次将毒性通路的概念融合进AOP框架，开发了一个关注人体健康的AOP网络模型，并进行了多化学物验证和定量评估，为构建人类健康相关的AOP及化合物安全评价提供研究思路。
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