摘要
烟草病毒病害分布广、危害重，是影响烟叶产量和质量的主要制约因素之一。我国烟草上先后报道了30多种病毒性病原，造成了持续性危害。其中，马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)自上世纪90年代由次要病原上升为主要病原，一直危害至今，而近年来原侵染番茄、造成番茄严重减产的番茄褪绿病毒（Tomato chlorosis virus,ToCV）陆续有侵染烟草的报道。鉴于有效防治植物病毒病药剂的缺乏，病毒病的早期和快速诊断尤其重要。基于此，本论文针对PVY和ToCV两种烟草病毒开展检测技术研究，通过克隆其外壳蛋白基因，利用原核表达系统表达并纯化其外壳蛋白，免疫动物制备多克隆抗体，以建立这两种病毒的血清学快速检测技术；同时，鉴于吩嗪类衍生物N-(1’-苯乙基)-吩嗪-1-酰胺（SQXA-12（3p））能够在细胞水平抑制禽传染性支气管炎病毒（IBV）的复制，测试了六种吩嗪类衍生物对植物病毒的抑制效果，具体结果如下： 根据NCBI中PVYN株系和ToCV基因组序列，分别设计扩增其CP基因的引物，通过RT-PCR方法克隆其CP基因，连接或重组至中间质粒pMD19-T或pDONR221，通过酶切鉴定法或重组法将目的基因转移至原核表达载体pET28a或pDEST17中，获得重组质粒pET28a-PVYCP和pDEST17-ToCVCP，重组质粒转化大肠杆菌BL21表达菌株并进行原核表达。表达产物经过SDS-PAGE电泳检测，显示成功表达出PVY CP（48kDa）和ToCV CP（31.30kDa）。利用Ni-NTA层析柱纯化这两种目的蛋白，然后作为抗原免疫兔子，分别获得两种病毒CP的多克隆抗体。间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测结果显示PVY CP和ToCV CP抗体效价分别达到1∶12800、1∶12800。蛋白免疫印迹（Western blot）试验显示该抗血清检测抗原分别为50ng、50ng。最后，利用Western blot检测两种抗血清对感病叶片的灵敏度，结果显示其灵敏度分别为1mg/mL、0.1mg/mL，在此基础上通过田间采样进行间接ELISA检测试验，结果显示这两种抗血清都分别能够检测番茄、烟草等寄主体内的相应病毒。因此，制备获得的PVY CP和ToCV CP抗血清可用于这两种病毒的田间检测。 众所周知，植物病毒病缺乏有效的防治药剂。课题组前期发现，吩嗪类衍生物（SQXA-12（3p））能够在细胞水平抑制IBV病毒的复制。基于此，以PVY为测试对象，通过药剂喷施、实时定量RT-PCR以及Western blot检测了六种吩嗪类衍生物N-(2-氟苯基)-N-甲基吩嗪-1-甲酰胺（3d）、N-(2-氯吡啶-4-基）吩嗪-1-甲酰胺(3g)、N-(2-氟苄基)吩嗪-1-甲酰胺(3m)、N-(3-氟苄基)吩嗪-1-甲酰胺(3n)、SQXA-12（3p）、N-(2-氨基乙基)吩嗪-1-甲酰胺(3q）对植物病毒的抑制效果。结果显示：两种施药方式下，即接种病毒前喷药和接种病毒后喷药，吩嗪-1-羧酸（PCA）及其6种衍生物及对马铃薯Y病毒复制均有不同程度的抑制作，抑制效果从强到弱依次为：3n、3d、3g、SQXA-12（3p）、3m、3q，但其抑制作用没有对照药宁南霉素效果显著。
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