摘要
目的： 本团队前期研究通过构建甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein,AFP）启动子编码MR报告基因铁蛋白基因（Ferritin heavy chain,Fth）以构建质粒(AFP@Fth)，并揭示了其在肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)中的早期诊断价值；而铁蛋白在肝癌细胞中特异性表达后，导致转铁蛋白受体(Transferrin receptor,TfR)特异性上调，可能对后续靶向作用产生影响。本研究通过制备转铁蛋白修饰纳米递药系统，探究AFP@Fth质粒转染对肝癌细胞的靶向能力及抗肿瘤药效的影响，旨在证明转染铁蛋白基因对HCC早期诊断和增强疗效的双重作用。 材料与方法： 用AFP@Fth质粒转染AFP阳性肝癌细胞HepG2；通过蛋白免疫印迹、免疫荧光及流式细胞术检测Fth在肝癌细胞中特异性表达及其所致的TfR上调；通过磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)扫描检测转染报告基因所致T2加权对比成像效果；同时采用薄膜分散法和硫酸铵梯度法制备阿霉素脂质体（LPD）并予以转铁蛋白（Transferrin,Tf）修饰，得到本研究靶向递药系统转铁蛋白修饰的阿霉素脂质体（Tf-LPD）；通过粒径测量、透射电镜及体外药物释放等实验确定相关表征；在体外细胞和体内均利用所制备递药系统验证转染对药物分布和后续疗效的影响。 结果： 蛋白印迹法证明转染AFP@Fth后肝癌细胞HepG2内Fth特异性过表达，免疫荧光法验证了细胞表面TfR进一步上调，MRI扫描证实转染后细胞在T2加权序列的对比成像，证明了质粒AFP@Fth在AFP阳性肝癌细胞中的特异性表达能力及MR成像功能。通过薄膜分散法和硫酸铵梯度法成功制备得到具有主动靶向性的递药系统Tf-LPD，其粒径大小为48.05±7.76nm，粒径分布均一。所制备的Tf-LPD具备（93.82±1.28）%的包封率及（10.26±0.72）%的载药量。体外药物释放实验结果证明了所制备载药脂质体制剂的缓释性能，且Tf的修饰对脂质体制剂的药物释放没有显著影响。通过Tf-LPD探究其对转染AFP@Fth处理的HepG2细胞治疗效果的影响，结果表明Tf-LPD对转染后的HepG2产生的细胞药效较未转染组更加明显。通过荧光标记脂质体考虑转染后HepG2对脂质体的摄取情况，结果表明HepG2细胞对Tf修饰的荧光脂质体的摄取明显强于无Tf修饰的荧光脂质体；此外，转染后的HepG2细胞对Tf修饰的荧光脂质体的摄取明显强于未经转染处理的HepG2细胞，说明转染AFP@Fth后提高了肿瘤细胞对Tf修饰的脂质体的摄取。体内实验结果亦与之相符，动物活体成像结果说明瘤内转染后予以Tf修饰的脂质体的裸鼠肿瘤模型的荧光信号明显强于未转染裸鼠，说明Tf修饰脂质体对转染AFP@Fth质粒的HepG2细胞的靶向能力增强。荷HepG2肿瘤裸鼠的药效学研究结果说明，转染处理后给予Tf-LPD治疗组对肿瘤的生长抑制效率最高，明显优于未转染Tf-LPD治疗组，且裸鼠对阿霉素脂质体制剂耐受良好；Hamp;E组织病理进一步证实转染后Tf-LPD治疗组较未转染组的抗肿瘤效果更好。 结论： 1.AFP@Fth在HepG2细胞中特异性表达，并诱导细胞表面TfR上调,细胞摄铁、储铁能力增强，达到在MR T2加权成像中的肝细胞癌早期诊断目的。 2.所制备的经Tf修饰的载药脂质体粒径分布均一，具有缓释、靶向功能。 3.靶向载药脂质体Tf-LPD对给予AFP@Fth转染的HepG2细胞的靶向能力和抗肿瘤作用明显提升，揭示AFP@Fth在作为MRI对比剂的同时，对肿瘤后续靶向治疗的增强作用。
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