摘要
鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)是引起雏鸭传染性浆膜炎的主要致病菌，是目前危害我国鸭场养殖业的最常见细菌病原之一。目前治疗该细菌引发的疾病多采用抗生素类药物。然而由于遗传变异、细菌耐药性等原因，抗生素治疗的有效性也越来越差，因此寻找新的替代性防治方法是养殖业急需解决的问题之一。 本研究通过微生物种间关系实验，筛选得到一批对鸭疫里默氏杆菌具有抑制作用的菌株，对菌株进行系统发育分析和利用基因组学分析其中可能的抑菌物质和抑制机制，同时本研究还对其他已知抗菌肽进行了表达和筛选，为鸭疫里默氏杆菌的生物防治提供一定的依据和理论基础。主要研究进展如下: (1)通过与11种常用药物药敏实验确定鸭疫里默氏杆菌RA-CC与RA-ZXP对多种抗生素具有耐受性，其中以氨基糖苷类、四环素类和氯霉素类最为显著。结合已知耐药基因的分子扩增验证，推测RA产生多重耐药性与其携带的耐药基因有一定相关性，这也为RA的防治提供新的依据和思路。 (2)从环境样品和保存菌种中共筛选分离纯化得到约20株鸭疫里默氏杆菌的拮抗菌，其中丝状链霉菌MEY2抑制能力最强，其次为多粘类芽孢杆菌MEZ6和MEY9。16S rDNA测序分析表明其中有10株为肠球菌属细菌，有5株菌株与NCBI数据库已知菌比对同源性小于98％。其他共接种实验发现多粘类芽孢杆菌抑菌谱最广，对大多数供试细菌均有抑制作用。 (3)共接种比例对鸭疫里默氏杆菌RA-CC抑制的影响。共培养实验发现MEY2与RA-CC在接种比例≤1∶10时，RA-CC即被完全抑制;而MEZ6与RA-CC在接种比例≤1∶1000时，RA-CC很快就被抑制，显微镜观察均无RA-CC的存在。将MEY2和MEZ6以及益生菌鼠李糖乳杆菌MEY7进行组合接种抑制多种致病菌，发现组合共接种的表型会与其中优势菌株单一接种保持一致。 (4)对多粘类芽孢杆菌MEZ6中11个主要抗菌性多肽的合成基因进行大肠杆菌系统异源表达。采用酶切酶连体系构建至pET32a表达载体，经过验证无误后转至BL21菌株进行IPTG诱导表达，其中9个蛋白能成功诱导表达，2个蛋白未能检测到有表达。将表达产物与细菌进行共接实验，发现与细菌共接的均无明显抑菌圈产生，推测单基因表达可能无法发挥功能，而这些构建可为完整合成途径的异源重建提供基础。 (5)其他的抗菌肽表达和筛选。从抗菌肽数据库APD筛选得到20个已知的广谱抗菌肽，其中抗菌肽AP03048和AP02856直接构建重组载体菌株对鸭疫里默氏杆菌有一定抑制效果，而采用其他融合蛋白的表达方式未产生明显抑制效果，表明异源表达方式对抗菌肽的活性具有重要影响。 综上所述，本论文通过微生物的分离纯化、共培养等实验得到对鸭疫里默氏杆菌具有较好拮抗能力的菌株，对代表性菌株进行了组学分析，预测其中可能的关键基因，并将其与其他抗菌肽进行异源表达及功能验证。本研究为基于微生物互作关系的鸭疫里默氏杆菌生物防治提供了新的微生物和基因资源。
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