不可控的大出血是创伤性死亡的主要原因，全世界每年约有190万人死于过度出血。凝血系统和血小板介导的原发性止血则是人体应对过度出血的重要防御机制。目前，人体乃至哺乳动物的凝血机制已得到较全面和深入的研究。以血小板的磷脂表面作为重要的反应平台，凝血因子通过瀑布式的酶级联反应激活。一系列酶级联反应的最终目的是产生凝血酶，使纤维蛋白原水解。纤维蛋白单体交联后，形成血凝块完成最终的凝血。然而，这种依靠机体自身逐步激活的方式，在紧急大出血的情况下无法有效止血，往往在形成凝血酶之前就已经失血过多而导致休克乃至死亡。因此，为了加快止血，止血材料通常需要满足两个条件的其中一个：能够加速凝血系统的激活过程或提供新的止血方式。其中，沸石类止血材料被认为能够有效加快凝血系统的激活。然而对于沸石促凝血机理的研究，依旧停留在表面，分子层面的促凝机制有待进一步探究。直到2021年，新的Ca基沸石表面酶原活化途径被揭示，Ca基沸石在凝血过程中起到“无机血小板”的作用，让无机-生物界面得到人们的重视。本文围绕凝血系统的核心蛋白酶——凝血酶在Ca基沸石表面的原位活化过程和构效关系，揭示了Ca基沸石促凝血作用的根源是其表面原位活化的凝血酶，并对其催化活性与吸附构象的关系进行了深入研究，揭示了Ca基沸石表面的无机-生物界面不仅能够活化酶原，还能够调控蛋白酶的催化活性。 我们首先通过对比研究Ca基沸石诱导与Ca离子诱导的凝血酶生成曲线，发现相比人体内发生的Ca离子诱导的凝血酶生成过程，Ca基沸石诱导的凝血酶生成曲线表现出约3倍的峰高，12倍的ETP（EndogeousThrombinPotential，内源性凝血酶潜能）。不仅如此，凝血酶的活力不会随时间而降低，说明其不会被抗凝血酶（Anti-thrombin）结合而失活。组织因子存在条件下，不改变Ca基沸石诱导的凝血酶生成曲线整体趋势。这些结果表明，相比传统的凝血酶激活过程，Ca基沸石激活的凝血酶具有更高的酶活力以及更强的稳定性。这种不同于传统方式的无机-生物界面的凝血酶生成曲线，揭示了发生在无机-生物界面的一种新的酶原高效活化途径，暗示了沸石促凝血的关键在于表面活化的凝血酶。 接着针对凝血酶的水解反应的催化活性，构建简化的沸石表面吸附模型，避开血浆复杂体系的干扰，定量研究Ca基沸石表面限域作用对凝血酶催化活性的影响。Thr@CaY的催化活性定量分析表明凝血酶在Ca基沸石表面的简单吸附会使凝血酶失活。受到原位活化模型中大量存在的血浆蛋白的启发，使用大量白蛋白（BSA）预吸附的方式将Thr@CaY改进为Thr-BSA@CaY，使其催化活性显著提高至FreeThr的三倍。该结果表明，通过调节Ca基沸石与凝血酶的无机-生物界面，能够控制其催化活性。 基于上述表面吸附模型中BSA预吸附对凝血酶水解催化活性的影响结果，进一步推测凝血酶在Ca基沸石表面的催化活性受其吸附构象影响。因此，利用活性二甲基标记作为探针，表征Ca基沸石表面凝血酶的吸附构象，建立Ca基沸石表面吸附凝血酶的构效关系。Ca基沸石表面吸附的凝血酶相比游离的凝血酶，有部分赖氨酸位点的标记效率显著降低（K459和K618），同时其余赖氨酸位点标记效率与FreeThr相近，表明Ca基沸石对凝血酶的限域作用是通过与凝血酶表面的特殊位点来实现，凝血酶在Ca基沸石表面的吸附存在择优取向。而恰巧凝血酶与Ca基沸石的结合位点位于凝血酶的功能性区域——外位点Ⅰ和Ⅱ上，使其在一定程度上受到沸石的空间位阻影响。而BSA的预吸附能有效缓解这种凝血酶表面特定位点与Ca基沸石的相互作用，同时使凝血酶的表面结构更加“松散”，使其更容易与小分子发色底物接触，从而导致其发色底物催化活性的提高。凝血酶吸附在两种不同硅铝比的Ca基沸石表面，在表现出相同的催化活性的同时，也表现出相近的吸附构象和结合位点，进一步证明了凝血酶的宏观催化活性受其在Ca基沸石表面的微观环境影响。 接着，基于米氏方程推导出凝血时间的倒数Tclot-1与凝血酶质量成正比的关系，并以此为基础对不同条件下Ca基沸石表面凝血酶的促凝血活性进行定量分析。分析结果表明Ca基沸石表面原位活化的凝血酶表现出8倍于自然活化的凝血酶，以及5倍于FreeThr的促凝血活性。这种提升远高于表面吸附模型中，凝血酶在Ca基沸石表面水解催化活性的3倍提升。根据凝血酶在Ca基沸石表面水解催化活性的构效关系研究，血浆蛋白和凝血酶在Ca基沸石表面的原位活化过程很可能会影响凝血酶的吸附构象。因此为建立Ca基沸石表面原位活化凝血酶的构效关系，探究性地提出一种基于免疫沉淀技术的分离纯化方法。第一步利用沸石与凝血酶之间的强相互作用，通过水洗去除与沸石作用力较弱的血浆蛋白再进行原位二甲基标记。第二步通过变性作用降低沸石与凝血酶之间的作用力，将沸石与含有凝血酶的血浆蛋白分离。第三步利用抗体-抗原的特异性相互作用将凝血酶与其他血浆蛋白分离。第四步通过质谱检测获得凝血酶的二甲基标记效率，分析沸石表面原位活化的凝血酶的吸附构象。虽然最终没有获得合适的免疫沉淀抗体，但为Ca基沸石表面原位活化凝血酶的吸附构象研究提供了新的思路。 最后，基于上述分子层面的机制研究，我们确定表面原位活化的凝血酶是沸石止血作用的关键。因此提出沸石类止血材料的放热作用不仅仅带来灼伤的副作用，更是降低其止血效果的不利因素。采用低放热的高硅铝比天然沸石，有利于沸石表面凝血酶在其适宜的工作温度下保持高活性，既保持了高促凝活性，又避免放热灼伤的安全风险，并通过家兔股动脉出血模型从有效性和安全性两方面对这一想法进行了验证。
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